PCR實驗室的污染及其防范措施

陳 永，楊蓮辭，常定發

（1.云南省瀘西縣動物疫病預防控制中心，云南 瀘西 652400；2.云南省瀘西縣動物衛生監督所，云南 瀘西）

隨著動物疫病檢測需求增加，PCR基因擴增實驗室業務量有所加大。開展PCR檢測，很可能會出現實驗室污染，影響實驗質量和效果，造成假陽性，同時也會給實驗人員健康造成損害。

1 PCR實驗室污染檢測評估

（1）因PCR檢測的樣品及其產物污染無色無味，主觀很難判斷，應定期對實驗室操作臺、地板、設備、器具等采集棉拭子樣進行檢測，評估是否存在污染。樣品要規范編號記錄，以便追溯。（2）查看實驗室最近疑似污染實驗檢測報告，看陰性對照（水）Ct值（反應管內營光信號達到設定的值時所經過的循環數）。陰性對照（水）Ct＞38，輕微污染；35＜Ct＜38，中等污染；Ct＜35，嚴重污染。如只是陰性對照污染，樣品中仍有陰性，則可能是樣品交叉污染或操作不當，通過規范仔細的重復操作以避免污染。如所有的曲線都呈陽性，而且陰性對照和許多標本的線性相似，則考慮是系統污染，如檢測試劑污染或氣溶膠污染。（3）試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA，進行PCR擴增，以監測試劑是否污染。

2 污染的來源

2.1 陽性樣本或陽性樣本核酸的污染 此類污染多發生于樣品處理間，造成樣品間的污染。在采集的樣品中，如存在陽性樣品，在樣品的采集、放置、運輸的過程中，由于封裝不嚴溢出于容器外，導致污染容器、樣品的交叉污染等；實驗過程中，移液器使用不當，吸液時回槍手速過快導致的移液器槍頭部分被陽性樣本污染；樣品加熱裂解核酸后，立即打開儀器熱蓋，反應管突然遇冷導致崩開，濺出核酸；核酸釋放后，未離心，管蓋上有液體，濺出導致的污染；吸取陽性對照的槍頭，處理不當造成的污染；由于通風不良，病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致交叉污染。

2.2 陽性對照的污染 在使用陽性對照時，未離心，導致陽性對照泄漏，造成的污染；吸取陽性對照的槍頭，處理不當造成的污染。陽性對照的泄露易造成試劑的污染。

2.3 PCR擴增產物污染 擴增過程中或擴增結束后，PCR管蓋未蓋嚴或崩開導致擴增產物泄露，造成的污染。因為PCR產物拷貝量大，擴增后的PCR管開蓋等動作容易產生氣溶膠，極微量的PCR產物污染，就可造成假陽性。

3 防范污染的措施

進行PCR檢測操作時，操作人員應該嚴格遵守操作規程，最大程度地降低可能出現的PCR檢測過程中的污染。

3.1 劃分操作區 實驗操作在三個不同的區域內進行，試劑配制、樣品處理和擴增要在不同的隔離區內進行：（1）試劑準備間：配置試劑、加陰性對照，要有單獨的一套移液槍、離心機、耗材，試劑配制應在獨立的生物安全柜內進行。該區域不做任何跟樣本相關的操作，嚴禁跟樣本相關的任何物品進入。（2）樣本處理間：樣本處理、核酸提取、加樣本核酸、陽性對照等。要有單獨的一套移液槍、離心機、耗材等。樣本提取應在獨立的生物安全柜內進行。該區域主要處理樣品，嚴禁帶未消毒的設備進入樣本處理間。（3）PCR擴增區及分析間：放置PCR儀、電腦及打印機等設備。任何一間的器材獨立使用，不要拿到其他兩個工作間。

3.2 實驗人員操作規范 （1）操作前佩戴好個人防護用品，用核酸祛除劑噴灑移液器、吸頭盒等，并放入生物安全柜中。（2）實驗人員操作時要穿戴各區間的專用工作服、手套、口罩等，完成一項操作或發現污染及時更換手套。實驗完成離開實驗室，更換工作服，脫掉手套、口罩等，嚴禁將工作服穿出實驗室外。（3）對一些活毒樣品在提取前，應將樣品用60 ℃ 水浴滅活處理不少于30 min，防止活病毒造成污染和擴散。（4）吸頭盒不用時保持關閉狀態，避免吸完樣品，特別是陽性對照的吸頭經過時造成污染。（5）取樣、加液前，應做瞬時離心，將管蓋、管壁上液體完全沉于管底。開蓋時動作要輕緩，防止液體濺出。使用移液器時要注意快壓慢放或使用帶濾芯的吸頭，防止液體污染移液器管頭。（6）實驗過程中最先加陰性對照，蓋好蓋子后再加待檢核酸，最后加陽性對照。用后的廢吸頭、其它廢棄物品、污染物等集中放入裝有10 % 84消毒液的廢液缸內，消毒液要能完全浸泡廢棄物品。（7）PCR擴增完成后，如無必要，盡量不要打開或少打開反應體系，如必須打開，應在獨立專用區域內進行。

4 污染的處理

4.1 輕度污染的處理 PCR板、八聯管板、離心機轉子用50 % 84消毒液浸泡30 min，反復幾次。操作臺面先酒精擦拭，再用30 % 84消毒液反復擦拭幾次，每次實驗前后都要用酒精對所有的操作臺面、移液槍、離心機進行擦拭。地面用30 % 84消毒水進行擦拭，1～2次/d。實驗環境通風、紫外線燈照射。經過以上方法處理，污染基本可以1周左右消除。

4.2 中度和重度污染的處理 （1）評估污染源頭：評估是環境污染、器材污染（尤其是移液槍和離心機）還是試劑盒污染。①準備一套新的移液槍、離心機、耗材、試劑盒。②用新的移液槍和原來試劑在新的環境配2個陰性對照上機擴增，如果沒有污染，說明試劑盒沒有問題；如果有污染，說明試劑盒有污染。用新的移液槍和新的試劑盒在原來環境配2個陰性對照上機擴增，如果沒有污染，說明環境沒有問題；如果有污染，說明環境有污染。用原來移液槍和新的試劑盒在新的環境配2個陰性對照上機擴增，如果沒有污染，說明移液槍沒有問題；如果有污染，說明移液槍有污染。（2）不同污染的處理：①器材污染：移液器污染移液槍不帶槍頭吸酒精，并把槍柄部分浸泡在酒精中，目的是使有機物溶解。再用移液槍不帶槍頭吸清水，反復幾次，目的是把酒精及有機物清洗掉，之后用移液槍不帶槍頭吸50 % 84消毒水，反復幾次，并停留30 min，最后用移液槍不帶槍頭吸清水，反復幾次，目的是把84消毒水清洗掉。以上操作重復幾次，再用三把移液器不帶槍頭吸清水，把清水當作樣品進行檢測，評估污染是否消除。離心板架或者八聯管板架污染，使用酒精浸泡后，再用清水清洗干凈，之后再用30 % 84消毒水浸泡30 min以上，最后再用清水清洗干凈，多重復幾次。離心機污染，使用酒精擦拭后，用清水反復擦拭，轉子用50 % 的84消毒液浸泡，再用清水洗干凈，晾曬干，再用棉簽取離心機拭子檢測，評估污染是否解除。②試劑盒污染，封存，用新的試劑盒實驗。③環境污染，30 % 84消毒液擦拭操作臺面2～3次，次數可根據實際情況增減。設備門把手、門窗把手和外部區域10 % 84消毒液擦拭2～3次。所有垃圾能用消毒水浸泡的浸泡，不能浸泡的無害化處理。地面采用拖把沾50 % 84消毒液進行反復拖地，1～2次/d。有紫外線的設備開啟紫外線燈照射30 min，房間內進行紫外線長時間照射消毒，每天進行 。環境保持通風，降低氣溶膠的蓄積，如果通風不暢的可采取風扇機械通風。處理后采集環境樣品進行檢測，評估污染是否消除。