一起兔巴氏桿菌病的診斷

葛向平

（山東省膠州市動物疫病預防與控制中心，山東 膠州 266300）

兔多殺性巴氏桿菌病是由兔多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）引起的一種接觸性、急性傳染病，由于病原的感染部位不同而呈現敗血癥、傳染性鼻炎、地方流行性肺炎、子宮積膿、睪丸炎和膿腫等病癥。該病呈散發性、多形性或地方流行性[1-2]。一般無季節性，在氣溫驟變及多雨季節容易發病，是嚴重危害養兔業的重要細菌性傳染病之一[3]。

1 發病情況

2020年10月，膠州一農戶飼養的20只3月齡兔，出現食欲廢絕、咳嗽、呼吸困難、打噴嚏、流鼻涕。發病兔腹瀉，排綠色稀便，眼結膜充血，個別兔出現四肢抽搐、歪頭等神經癥狀，死亡5只，其它兔個別精神不振。

2 剖檢癥狀

剖檢死亡兔可見肺出血、氣管環出血，肝臟腫大，表面有灰黃色或灰白色壞死點，脾臟呈現暗紅色，表面有出血點，腸黏膜充血，有出血點。

3 實驗室診斷

3.1 涂片檢查 無菌取發病兔肝臟、脾臟剪碎，制成涂片，經革蘭氏染色后，鏡檢，顯微鏡下發現大小一致、兩端鈍圓的球桿狀或短桿狀革蘭氏陰性菌。

3.2 細菌分離培養 無菌取發病兔肝臟分別接種于含0.1 % 牛裂解血球全血及4 % 小牛血清的改良馬丁肉湯瓊脂平板和麥康凱培養基中，37 ℃培養24 h后，可見麥康凱培養基中沒有菌落生長，而在含0.1 % 牛裂解血球全血及4 % 小牛血清的改良馬丁肉湯瓊脂平板上生長良好，菌落邊緣整齊，光滑、濕潤、灰白色菌落。分離菌用革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性短小桿菌，均符合巴氏桿菌培養特性。

3.3 生化鑒定 （1）糖發酵試驗：取分離菌株接種糖發酵管培養基，37 ℃ 培養24 h后觀察結果，能發酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、果糖，不發酵乳糖。（2）吲哚試驗：將分離菌株接種于色氨酸肉湯培養基，37 ℃ 培養24 h，滴加Kovacs靛基質試劑2～3滴，立即觀察結果，反應陽性。（3）氧化酶試驗：取一片氧化酶試紙，用一滴無菌水潤濕試紙，用玻璃棒或一次性塑料接種環挑取分離菌株涂于紙片上，觀察1 min，呈陽性反應。

3.4 PCR鑒定 （1）引物設計：參照文獻[4]設計多殺性巴氏桿菌PCR鑒定引物，擴增片段長度為460bp，序列如下：F：5’-ATCCGCTATTTAC CCAGTGG-3’，R：5’-GCTGTAAACGAACTCG CCAC-3’。（2）PCR樣品處理：取分離菌加入含10μl雙蒸水的小離心管中，95 ℃ 加熱10 min，冰浴10 min后作為PCR擴增模板，用雙蒸水作陰性對照。（3）PCR擴增及電泳：反應體系：模板 2 μl，10 × PCR Buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，2.5 mM dNTP 2 μl，上、下游引物各1 μl，Taq酶0.3 μl，然后加水至25 μl。反應程序：94 ℃ 預變性5 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃ 復性1 min，72 ℃ 延伸2 min，共30個循環；72 ℃ 延伸10 min，轉入4 ℃ 終止反應。經1 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，被檢樣品出現460 bp大小的DNA帶，陰性對照無條帶。

4 結論

通過臨床診斷和實驗室診斷，確診該養殖戶病兔為巴氏桿菌感染，兔巴氏桿菌病是威脅養兔業的嚴重疫病，為避免該疫病的發生，應及時做好防控工作，按時免疫，一旦發現疾病，立即采取措施，進行治療與控制。