結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎患者中假陰性的危險因素分析

鄒興武， 周 華， 符一騏， 周建英

結(jié)核性胸膜炎由結(jié)核分枝桿菌（MTB）通過淋巴、血行或胸膜下肺部結(jié)核病灶直接蔓延至胸膜，引起胸膜介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生胸腔積液引起的。在單側(cè)胸腔積液病原菌中MTB占30%～60%。結(jié)核性胸膜炎缺乏典型的臨床表現(xiàn)和影像學(xué)特征，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室診斷方法陽性檢出率低，而逐漸開展的胸膜活檢或胸腔鏡檢查屬于有創(chuàng)性檢查，特別對老年患者應(yīng)用有一定限制，對結(jié)核性胸膜炎的早期診斷有一定的局限性[1-2]。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）是一種針對結(jié)核感染的體外診斷試驗(yàn)，該方法應(yīng)用MTB的RD1區(qū)域編碼早期分泌抗原靶蛋白-6（ESAT-6）和培養(yǎng)濾過蛋白-10（CFP-10）作為特異性抗原，檢測外周血效應(yīng)T細(xì)胞經(jīng)過抗原刺激后分泌γ干擾素的情況。結(jié)核病患者中，T-SPOT.TB的總體靈敏度85.0%，特異度92.5%。由于它無法區(qū)分活動性結(jié)核與潛伏結(jié)核感染，目前認(rèn)為其陰性結(jié)果時，臨床首選排除結(jié)核病診斷[3-4]。文獻(xiàn)報(bào)道高齡、服用非甾體藥物、外周血單個核細(xì)胞減少等因素會造成T-SPOT.TB假陰性[5-8]。本文以特定的結(jié)核性胸膜炎患者為研究對象，對影響T-SPOT.TB假陰性的可能危險因素進(jìn)行篩選及分析，以期提高T-SPOT.TB試驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院2014年1月－2015年6月收治住院的診斷為結(jié)核性胸膜炎并行T-SPOT.TB檢查的患者。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS 288—2017版；臨床診斷病例：結(jié)核性胸膜炎患者，胸水表現(xiàn)為滲出液、腺苷脫氨酶（ADA）升高。同時具備下列條件之一者：結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)中度陽性或強(qiáng)陽性、干擾素釋放試驗(yàn)陽性、MTB抗體陽性，并排除其他肺部疾病。確診病例：①胸水病原學(xué)檢查，符合涂片顯微鏡檢查陽性或分枝桿菌培養(yǎng)陽性，菌種鑒定為MTB復(fù)合群；②胸膜病理學(xué)檢查符合結(jié)核改變者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＜18歲；②病例資料不齊；③隨訪不足12個月；④培養(yǎng)結(jié)果為非結(jié)核分枝桿菌；⑤長期使用激素；⑥HIV感染者；⑦患有免疫系統(tǒng)疾病。共有239例患者納入研究，根據(jù)T-SPOT.TB的檢測結(jié)果，分為假陰性組和陽性組。T-SPOT.TB假陰性組33例患者中，男24例，女9例，年齡平均（55.6±17.0）歲；合并肺外結(jié)核8例（24.2%），其中結(jié)核性腹膜炎2例、結(jié)核性心包炎5例、腸結(jié)核1例。T-SPOT.TB陽性組206例患者中，男137例，女69例，平均（41.1±17.7）歲；合并肺外結(jié)核11例（5.3%），其中結(jié)核性腹膜炎7例、結(jié)核性心包炎2例、結(jié)核性腦膜炎1例、結(jié)核性盆腔炎1例。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

收集患者的臨床特征及實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)等進(jìn)行單因素分析。將P＜0.05的單因素納入兩組間多因素logistic回歸分析，同時將年齡按青年組（18～39歲）=1、中年組（40～59歲）=2、老年組（60歲以上）=3賦值設(shè)置虛擬變量進(jìn)行分層分析。由于部分患者入院后因胸水量少，未行胸水常規(guī)、生化檢查，為提高多因素logistic回歸分析統(tǒng)計(jì)意義，未將胸水的相關(guān)檢驗(yàn)值納入多因素logistic回歸分析。

T-SPOT.TB的實(shí)驗(yàn)室操作：采用Oxford Immuunotec Ltd的T-SPOT.TB試劑盒并嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，肉眼觀察結(jié)果，計(jì)數(shù)著色的斑點(diǎn)。以任一個ESAT-6或CFP-10檢測孔達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)判定為陽性：如果陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)＜5個，以檢測孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6為陽性； 如果陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個，以檢測孔斑點(diǎn)數(shù)≥2倍的陰性對照孔斑點(diǎn)數(shù)為陽性，如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性對照孔正常時檢測結(jié)果為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。臨床數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不符合正態(tài)分布以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）或相應(yīng)例數(shù)表示，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)來比較分析組間指標(biāo)。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)及百分?jǐn)?shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析采用logistic逐步回歸。

2 結(jié)果

2.1 與T-SPOT.TB假陰性結(jié)果相關(guān)的單因素分析

單因素分析發(fā)現(xiàn)年齡、吸煙、飲酒、入院前病程、抗結(jié)核治療、T-SPOT.TB檢查前給予胸腔抽液檢查、合并肺外結(jié)核、血紅蛋白、外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、外周血單核細(xì)胞計(jì)數(shù)、胸水白細(xì)胞計(jì)數(shù)、胸水淋巴細(xì)胞百分比、胸水總蛋白、胸水ADA與T-SPOT.TB假陰性結(jié)果存在顯著相關(guān)（表 1）。

表1 結(jié)核性胸膜炎患者中T-SPOT.TB假陰性危險因素的單因素分析Table 1 Univariate analysis of the risk factors for false negative result of T-SPOT.TB test in patients with tuberculous pleurisy

2.2 與T-SPOT.TB 假陰性結(jié)果相關(guān)危險因素多因素logistic回歸分析

在單因素分析的基礎(chǔ)上，將年齡、血紅蛋白、外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、入院前時間、既往肺結(jié)核、抗結(jié)核治療、T-SPOT.TB檢查前給予胸腔抽液檢查、吸煙、飲酒和合并肺外結(jié)核采用多因素偏最大似然估計(jì)法逐步logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡是獨(dú)立危險因素。對年齡進(jìn)行分層分析后發(fā)現(xiàn)，隨年齡的增長，出現(xiàn)T-SPOT.TB假陰性的風(fēng)險越高。另外T-SPOT.TB檢查前曾行胸腔抽液檢查、抗結(jié)核治療、合并肺外結(jié)核是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立危險因素。而外周血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是T-SPOT.TB假陰性的保護(hù)因素，提示外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量越多，發(fā)生假陰性的風(fēng)險越小，淋巴細(xì)胞減少是T-SPOT.TB假陰性的獨(dú)立危險因素（表2）。

表2 結(jié)核性胸膜炎患者中T-SPOT.TB假陰性危險因素的多因素logistic回歸分析結(jié)果Table 2 Multivariate logistic regression analysis of the risk factors for false negative result of T-SPOT.TB test in patients with tuberculous pleurisy

3 討論

新發(fā)肺結(jié)核患者中伴有結(jié)核性胸膜炎者占4.7%～17.6%[9]。該疾病常常急性起病，胸膜纖維化等并發(fā)癥發(fā)生率較高。因此該疾病的早期診斷、及時有效的治療對改善患者預(yù)后有重要的意義。近年來，T-SPOT.TB檢測技術(shù)因其較高的靈敏度和特異度，在結(jié)核性疾病的診斷中得到廣泛關(guān)注。該技術(shù)是使用MTB特異性抗原刺激外周血T淋巴細(xì)胞，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)方法，對能分泌γ干擾素的抗原特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而判斷結(jié)核感染狀態(tài)，缺點(diǎn)是無法區(qū)分活動性結(jié)核與潛伏結(jié)核感染，臨床工作中陰性結(jié)果更有意義。所以近年來，對其假陰性影響因素的研究受到人們的關(guān)注。2009年Liao等[7]報(bào)道在肺結(jié)核患者中高齡和接受激素治療是T-SPOT.TB假陰性的危險因素 ，2013年Lee等[8]對128例肺外結(jié)核患者的研究中發(fā)現(xiàn)僅結(jié)核性腦膜炎與T-SPOT.TB假陰性有關(guān)，而年齡、性別、HIV感染、是否合并肺結(jié)核等因素?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 。2015年P(guān)an等[5]再次的大樣本研究結(jié)果顯示，在肺結(jié)核患者中年齡、超重、發(fā)病時間＞6個月，在肺外結(jié)核患者中高齡是T-SPOT.TB假陰性的危險因素 。總之，目前T-SPOT.TB假陰性影響因素的相關(guān)研究較少，且未有針對某一類型結(jié)核性疾病的研究，難以個體化應(yīng)用于臨床。

本文采用多因素logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)在結(jié)核性胸膜炎患者中年齡、外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量、合并肺外結(jié)核、抗結(jié)核治療是T-SPOT.TB試驗(yàn)假陰性結(jié)果的獨(dú)立危險因素。隨著年齡的增長，T-SPOT.TB假陰性的概率逐漸升高，結(jié)合國內(nèi)外相關(guān)研究，分析其可能的機(jī)制是隨著年齡的增長，人體固有免疫和適應(yīng)性免疫能力均相對下降，而T細(xì)胞作為免疫反應(yīng)過程中的重要部分，其增殖、分化、分泌細(xì)胞因子等生物學(xué)能力也相應(yīng)下降[10]。結(jié)核性胸膜炎是一種依賴于T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，當(dāng)機(jī)體免疫水平下降時，在結(jié)核抗原刺激下不能產(chǎn)生有效免疫應(yīng)答，因此隨著年齡的增長，淋巴細(xì)胞對抗原的應(yīng)答能力下降是導(dǎo)致T-SPOT.TB靈敏度受損的主要原因。

本研究顯示，外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量也與T-SPOT.TB的假陰性有關(guān)。一般來講，淋巴細(xì)胞的數(shù)量可反映機(jī)體的免疫能力，當(dāng)淋巴細(xì)胞總數(shù)減少時，產(chǎn)生的細(xì)胞因子也相應(yīng)減少，機(jī)體的免疫效力降低，在一定程度上對多種疾病的診療和預(yù)后有較好的提示意義。當(dāng)結(jié)核桿菌感染機(jī)體時，經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理后MTB致敏T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞快速增殖、分化，成為發(fā)揮功能的效應(yīng)性T細(xì)胞，因此淋巴細(xì)胞數(shù)，尤其是T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和功能均有可能成為T-SPOT.TB的檢測結(jié)果的影響因素。T-SPOT.TB檢查時統(tǒng)一將送檢樣本中單個核細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行標(biāo)化處理，調(diào)整為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞濃度，一定程度上糾正了細(xì)胞數(shù)量對檢驗(yàn)結(jié)果的影響。然而研究顯示，結(jié)核性胸膜炎患者外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量越多，發(fā)生假陰性的比例越小，T淋巴細(xì)胞的數(shù)量變化在此過程的意義仍需進(jìn)一步分析完 善。

臨床工作中，對胸腔積液患者，常行胸腔抽液檢查，抽取胸水后，結(jié)核性胸膜炎患者再行T-SPOT.TB檢查的假陰性率會升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在結(jié)核性胸膜炎中，機(jī)體的免疫細(xì)胞受感染局部細(xì)胞因子的趨化作用在胸腔聚集，胸腔積液中的單個核細(xì)胞數(shù)量較外周血單個核細(xì)胞（PBMC）顯著增多，抗原特異性T細(xì)胞的數(shù)量可能達(dá)到PBMC中的15倍[11-12]。推測抽取胸腔積液后，在局部病灶的刺激下機(jī)體會再次分泌胸腔積液，抗原特異性T細(xì)胞繼續(xù)向胸膜腔遷移加劇外周血抗原特異性細(xì)胞比例失調(diào)。如前所述，T-SPOT.TB檢測的是體外分泌γ干擾素的抗原特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞，當(dāng)外周血的效應(yīng)T細(xì)胞減少時，一定程度上會影響T-SPOT.TB的敏感性。有報(bào)道多種漿膜腔積液（如肺泡灌洗液、腹水等）中也有類似表現(xiàn)，即感染局部的T細(xì)胞數(shù)量顯著高于外周血[13-14]。這可能解釋了當(dāng)患者合并多漿膜腔積液時容易出現(xiàn)假陰性的原因。T-SPOT.TB假陰性組中，大部分患者合并的肺外結(jié)核為多漿膜腔積液，僅有1例腸結(jié)核患者，仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)該患者存在中重度營養(yǎng)不良，初步推測T-SPOT.TB假陰性可能與營養(yǎng)不良引起免疫受損有關(guān)。而當(dāng)患者抗結(jié)核治療后，體內(nèi)的MTB逐漸被清除，而結(jié)核抗原特異性效應(yīng)T細(xì)胞隨之減少甚至消失，因此均有可能出現(xiàn)T-SPOT.TB的假陰性結(jié)果[15]。此外，Lee等[6]也發(fā)現(xiàn)T-SPOT.TB陽性結(jié)果與外周血抗原載體數(shù)量密切相關(guān) 。

本研究在單因素分析中發(fā)現(xiàn)，胸腔積液中淋巴細(xì)胞比例在兩組患者之間具有顯著差異，由于部分患者就診時已經(jīng)出現(xiàn)了胸膜粘連或者胸水很少，通過胸腔鏡病理診斷而明確，無胸腔積液檢驗(yàn)結(jié)果，為提高統(tǒng)計(jì)效能，因此沒有進(jìn)一步進(jìn)行多因素回歸分析，期待在更大樣本中進(jìn)行觀察分析。兩組中胸腔積液ADA無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異可能也與樣本數(shù)較少有關(guān)。

綜上分析，結(jié)核性胸膜炎患者中高齡、外周血淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、胸腔抽液檢查、多部位肺外結(jié)核、抗結(jié)核治療會導(dǎo)致T-SPOT.TB試驗(yàn)假陰性概率升高，可能與機(jī)體的免疫功能下降和外周血中效應(yīng)T淋巴細(xì)胞減少有關(guān)。提示在臨床工作中需要慎重對待T-SPOT.TB陰性結(jié)果，尤其遇到高齡、外周血淋巴細(xì)胞減少癥、多部位肺外結(jié)核、T-SPOT.TB檢查前給予胸腔抽液檢查和抗結(jié)核治療期間的結(jié)核性胸膜炎患者。