山西省仔豬黃白痢大腸桿菌耐藥性研究

馮曉東 劉風波 連亮亮

摘? 要：采用Kirby-Bauer法，以分離自山西省10家規(guī)?；i場的60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株為材料，開展對獸醫(yī)臨床上常用的16種抗生素的耐藥性監(jiān)測。結(jié)果表明，60株病原性大腸桿菌分離株對抗生素已普遍具有耐藥性，其中對復(fù)方新諾明（88.3%）、氯霉素（81.7%）、鏈霉素（78.3%）、呋喃唑酮（75.0%）和氨芐青霉素（73.3%）等的耐藥性很強，對環(huán)丙沙星及諾氟沙星的耐藥性也較高，其耐藥率分別為60.0%和56.7%。

關(guān)鍵詞：仔豬黃白痢;大腸桿菌;耐藥率;藥敏試驗

中圖分類號：S852.61 文獻標志碼：A 文章編號：1001-0769（2021）06-0026-05

仔豬黃白痢為新生仔豬常見的大腸桿菌病，會嚴重危害養(yǎng)豬生產(chǎn)，并會造成巨大的經(jīng)濟損失。對于本病的防治，豬場除了加強飼養(yǎng)管理和衛(wèi)生消毒措施，以及用自家流行菌株免疫母豬，唯有多選用敏感藥物進行治療;然而，大腸桿菌具有眾多的血清型，各地流行菌株的血清型各不相同。隨著抗生素的大量使用，大腸桿菌的耐藥性菌株也不斷出現(xiàn)。為了摸清山西省各地仔豬黃白痢流行病原菌株，指導(dǎo)豬場臨床用藥，本研究對省內(nèi)各地豬場的新生仔豬黃白痢病例進行了病原分離、鑒定和耐藥性監(jiān)測。

1? 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病料

因發(fā)生仔豬黃白痢，山西省10家規(guī)模化豬場仔豬病死60例，在仔豬死后24 h內(nèi)，采集病變的組織或器官樣本，采集過程中要盡可能避免樣本被污染。

1.1.2 質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC25922購于中國獸藥監(jiān)察所。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

試驗所用儀器設(shè)備有比濁管、試管、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、酒精燈、恒溫培養(yǎng)箱、冰箱、打孔器、真空抽氣機、干燥器、測量尺、電子天平、超凈工作臺。

1.1.4 標準比濁管的制備

取10支比濁管，給第1支比濁管裝入0.048 mol/L（即濃度為1.175%）氯化鋇? ? ? ? 0.5 mL，加0.18 mol/L（即濃度為1%）硫酸溶液99.5 mL，充分攪勻，隨后的9支濁管依次類推，濃度逐漸升高。選管徑與接種菌液相同的試管，每支分裝10 mL，密閉，在室溫下置于暗處保存，其濁度為0.5麥氏比混標準（Mcfarland standard），相當于108 CFU/mL的含菌量。使用前應(yīng)充分搖勻[1]。

1.1.5 接種菌液的制備

稱取營養(yǎng)瓊脂4.5 g溶于100 mL蒸餾水中，加熱溶解，然后放入高壓鍋高壓滅菌? ? 20 min。待冷卻至50 ℃～60 ℃之后取出，在超凈工作臺內(nèi)將溶液傾倒入經(jīng)過滅菌的平皿中，待其冷卻凝固后取病料接種菌種。接種完畢后置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h備用。

用滅菌的接種環(huán)挑取瓊脂平板上形態(tài)相同的4～5個菌落，接種于3 mL～5 mL水解酪蛋白（mueller-hinton，M-H）肉湯中，在35 ℃下培養(yǎng)6 h，隨后用滅菌生理鹽水稀釋培養(yǎng)液，使其濃度相當于標準比濁管[2]。

1.1.6 培養(yǎng)基的制備

制備普通營養(yǎng)肉湯、普通營養(yǎng)瓊脂、葡萄糖蛋白胨、M-H培養(yǎng)基（K-B試驗專用）瓊脂。

1.1.7試驗藥物

氨芐青霉素（ampcillin，Amp）、氯霉素（chloramphenicol，CM）、紅霉素（eryhromyci，Ery）、慶大霉素（gentamicin，GM）、丁胺卡那霉素（amikacin，Amk）、鏈霉素（gtreptomyces，SM）、復(fù)方新諾明（gulfamethoxazole，Sxt）、新霉素（neomin，N）、呋喃唑酮（furazolidone，F(xiàn)d）、諾氟沙星（norfloxacin，Nor）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、頭孢唑啉（cefazolin，Cfz）、強力霉素（doxcycline，Dox）、氟苯尼考（florfenicol，F(xiàn)LO）、多粘菌素（polymyxin，PXB）和恩諾沙星（enoxacin，ENO）共16種藥物純粉。

1.1.8藥敏紙片的制備

制備好的干燥藥敏紙片分裝在密封小瓶內(nèi)，放在干燥器中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌的分離培養(yǎng)

挑選單個菌落，經(jīng)染色鏡檢證明不含雜菌，此時用接種環(huán)挑選單個菌落，移植于各種瓊脂斜面培養(yǎng)，所得的培養(yǎng)物即為純培養(yǎng)物，培養(yǎng)后膠塞密封，置-4O ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鏡檢

將待檢菌株做成菌液涂片，用革蘭染色法染色，選取在顯微鏡視野中顯示為紅色或粉紅色的兩端鈍圓、兩端濃染的中等大小的革蘭陰性桿菌菌株進行生化鑒定。

1.2.3 菌株的生化鑒定

按常規(guī)方法進行三糖鐵試驗、吲哚試驗、甲基紅驗、二乙酰試驗、糖發(fā)酵試驗、檸檬酸鹽利用試驗。

1.2.4 致病性試驗

取120只體重18 g～22 g的健康小白鼠。挑取普通瓊脂斜面上純培養(yǎng)的菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。隨機選取60只小白鼠作為試驗組，腹腔注射肉湯培養(yǎng)物0.1 mL/只;剩下的60只小白鼠作為對照組，腹腔注射肉湯0.1 mL/只，24 h～48 h內(nèi)觀察小鼠的死亡情況，取死亡或發(fā)病的小白鼠肝臟抹片，革蘭染色、鏡檢，并取病料接種于麥康凱瓊脂觀察結(jié)果。

1.3 藥敏試驗

本藥敏試驗采用紙片瓊脂擴散法。

2? 試驗結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)

在普通瓊脂平皿板上長出表面光滑、濕潤、半透明、灰白色、圓形微凸起、中等大的菌落，直徑2 mm～3 mm。在血液瓊脂平板上長出菌落較大、邊緣整齊并有隆起的灰白色菌落，多數(shù)不溶血。在麥康凱瓊脂平板上生長出圓形、光滑、隆起、大小均一的紅色菌落（中央顏色稍深）;普通肉湯呈均勻一致混濁狀。

2.2 細菌形態(tài)學觀察

病死仔豬的組織培養(yǎng)物涂片染色鏡檢，均可見兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭陰性短桿菌。

2.3 動物致病力試驗結(jié)果

在試驗組60只小白鼠中，42只在24 h內(nèi)死亡，16只在30 h死亡，另外2只發(fā)病;對照組小白鼠不發(fā)病。發(fā)病及死亡小白鼠的心血抹片經(jīng)革蘭染色鏡檢為革蘭陰性中等小桿菌，將該心血接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上均為紅色菌落。

2.4 生化鑒定結(jié)果

60株菌均能在三糖鐵培養(yǎng)基上產(chǎn)酸產(chǎn)氣，使培養(yǎng)基變黃，均不產(chǎn)生硫化氫，均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇。甲基紅（methyl red，M-R）試驗、吲哚試驗為陽性。均不能利用檸檬酸鹽，伏-波試驗（voges-proskauer，V-P）試驗陰性。根據(jù)生化特性，表明分離的菌為大腸桿菌（表1）。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

2.5.1 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株對16種抗生素的耐藥情況

仔豬黃白痢大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性嚴重的抗生素依次為SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM、NOR、AMK、ENO、N、ERY、DOX、CFZ、PXB，其中耐藥率大于或等于50%的? ? 9種抗生素，分別為SXT、CM、SM、FD、AMP、FLO、CIP、GM和NO;耐藥率小于30%的抗生素有3種，分別為DOX、CFZ、PXB;結(jié)果見表2和圖1。

2.5.2 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株對16種抗生素的多重耐藥情況

在60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株中，沒有不耐藥和僅耐1種、2種抗生素的分離菌株，對3種、4種、5種、8種、9種、10種、11種、13種和14種抗生素有耐藥性的大腸桿菌分離株分別為2株、5株、4株、7株、3株、15株、11株、8株和5株，結(jié)果見圖2。

2.5.3 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株的耐藥譜

60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株有45種耐藥譜。4株分離株的耐藥譜完全相同，大多數(shù)分離株都具有不同的耐藥譜。主要的耐藥譜見表3。

3? 分析與討論

3.1 60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株藥敏試驗及耐藥譜分析

采用Kirby-Bauer法，60株仔豬黃白痢大腸桿菌分離株的藥敏試驗結(jié)果（圖1）表明，在16種抗生素中，抑菌作用最強的是獸醫(yī)臨床上尚未使用或應(yīng)用較少的頭孢唑啉和多粘菌素，敏感菌株分別占90.0%（54/60）、90.0%（54/60）;其次為強力霉素、紅霉素、新霉素和恩諾沙星，敏感菌株分別占73.3%（44/60）、70.0%（42/60）、68.3%（41/60）和63.3%（38/60）;而復(fù)方新諾明、氯霉素、鏈霉素、呋喃唑酮和氨芐青霉素等藥物則表現(xiàn)出很高的耐藥性，耐藥率分別為88.3%、81.7%、78.3%、75.0%和73.3%;環(huán)丙沙星及諾氟沙星的耐藥率也很高，分別為60.0%和56.7%。這與國內(nèi)外有關(guān)文獻大體吻合。馬紅霞等報道，大腸桿菌對氧氟沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素、慶大霉素、卡那霉素、呋喃妥因同時耐藥的菌株已達半數(shù);RolandLanz等報道豬（腹瀉、水腫?。┐竽c桿菌分離株對慶大霉素、鏈霉素、壯觀霉素、四環(huán)素、呋喃妥因的耐藥性多見，對恩諾沙星的耐藥率較高。

3.2關(guān)于抗菌藥物的使用方法

抗菌藥物的選擇應(yīng)考慮采取聯(lián)合用藥、交叉用藥、輪換用藥的方式，一方面可以充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，增加療效：另一方面可以避免細菌長期與某一種藥物接觸，增加耐藥性的產(chǎn)生概率。

建議停用已普遍產(chǎn)生耐藥性和臨床上已明顯無效的藥物，選用目前應(yīng)用較少和經(jīng)藥敏試驗證明對仔豬黃白痢大腸桿菌敏感的先鋒霉素、多粘菌素、壯觀霉素等藥物。敏感藥物的選擇空間十分狹小，而研發(fā)新藥又需要大量的人力、物力和財力，并且還有研制周期長、風險大等問題[3]，因此，開展聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物的研究，充分發(fā)揮抗菌藥物之間的協(xié)同作用，顯得十分必要和迫切。

4? 結(jié)論

隨著抗生素在養(yǎng)豬生產(chǎn)中不斷使用，耐藥性菌株不斷涌現(xiàn)，且出現(xiàn)的菌株多為對多種甚至是14種抗生素有耐藥性，這些結(jié)果與杜銀中、朱力軍及馬紅霞等報道的基本一致。如果在生產(chǎn)中仍不加控制地使用抗生素，隨著時間的推移，大腸桿菌的耐藥率必將大幅度上升，多重耐藥菌株將迅增，耐藥譜增寬[4]，豬病的防治將面臨嚴峻的挑戰(zhàn)。因此，廣大養(yǎng)豬生產(chǎn)者應(yīng)嚴格遵守禁抗令，給動物生產(chǎn)營造一個科學的用藥環(huán)境。

參考文獻

[1] 熊焰，李德生，張和民，等. 大腸桿菌的藥敏試驗[J]. 中國獸醫(yī)科技，1999，29（3）：35-36.

[2] 石巖，梅世昌. 醫(yī)學動物實驗實用手冊[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[3] 王秀茹. 預(yù)防醫(yī)學微生物及檢驗技術(shù)（第二版）[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[4] 任家琰，馬海利. 動物病原微生物學[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，2001.