藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群變化觀察

趙金華，徐明，朱美君，孫曉娟

南通市第一人民醫院兒科，江蘇南通226001

癲癇是由不同病因引起的，腦部神經元高度同步化的異常放電所致，是一種慢性的、反復出現的發作性疾病。癲癇為患兒最常見的神經系統疾病，患病率在0.3%～0.9%［1］。大約三分之一的癲癇患兒最終發展為難治性癲癇［2］。盡管通過藥物、飲食、手術、迷走神經刺激等方法，難治性癲癇仍然無法得到控制，而生酮飲食治療難治性癲癇已取得確切療效［3］。越來越多的研究表明，癲癇發病可能與腦腸軸失衡有關［4］。腸道微生物群通過腸—腦相互作用在廣泛的神經障礙中發揮作用，但腸道菌群變化與難治性癲癇的關系目前少見報道。我們以健康患兒及藥物治療反應性癲癇患兒作為對照，觀察了難治性癲癇患兒的腸道菌群變化，從而明確腸道菌群與難治性癲癇的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選取2019年9月-2020年6月在南通市第一人民醫院兒科就診的初診癲癇患兒50例（癲癇組），男35例、女15例，年齡1～10（4.97±2.30）歲。選同期在南通市第一人民醫院兒保門診體檢健康的患兒25例作為對照組，其中男17例、女8例，年齡1～10（4.64±2.23）歲。入組癲癇患兒及健康患兒均獲得監護人的知情同意。入組癲癇患兒根據癲癇藥物治療原則［5-6］進行抗癲癇治療。根據抗癲癇治療效果將患者分為藥物難治組（抗癲癇治療6個月癲癇發作減少≤50%）19例和藥物反應組（癲癇發作減少＞50%）31例。藥物難治組使用抗癲癇藥物有丙戊酸鈉（VPA）16例；奧卡西平（OXC）11例；左乙拉西坦（LEV）7例；托吡酯（TPM）5例；拉莫三嗪（LTG）4例；氯硝西泮（CZP）2例；氨己烯酸（VGB）1例。藥物反應組使用抗癲癇藥物有VPA 20例；OXC 11例；LEV 6例；TPM 3例。

1.2 腸道菌群的分析采用高通量測序分析方法。收集癲癇組患兒治療前、治療6個月后及對照組患兒的糞便標本，取糞便的中段樣本，每份標本重量應大于5g，標本采集后立即冷凍，運送到高通量測序服務公司（南京金域醫學檢驗所有限公司）。對糞便樣本提取細菌總DNA，隨后進行16 S靶向擴增、物種注釋及豐度分析，并與現有的健康腸道菌群數據庫進行比對，得到所有樣本的菌群數據譜。

1.3 統計學方法采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以±s表示，兩組比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析、進一步組間比較采用LSD-t檢驗；計數資料以頻數或百分率表示，比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物反應組、藥物難治組、對照組腸道菌群多樣性分析結果癲癇組、對照組腸道菌群多樣性分別為3.41±0.28、3.25±0.26，兩組比較，t=2.408，P＜0.05。藥物難治組、藥物反應組腸道菌群多樣性分 別 為3.55±0.24、3.33±0.27，兩 組比 較，t=2.987，P＜0.05。

2.2 藥物反應組、藥物難治組、對照組門水平優勢菌及差異組成分析結果藥物難治組治療前檢出擬桿菌門及厚壁菌門分別為4、10例，F/B 2.50；治療后檢出B、F分別為8、7例，F/B 0.87。藥物反應組治療前檢出B、F分別為15、11例，F/B 0.73；治療后檢出B、F分別為17、8例，F/B 0.47。對照組檢出B、F分別為26、12例，F/B 0.46。門水平的優勢菌群組成中，差B及F對照組、藥物反應組治療前后的優勢菌群均為擬桿菌門；藥物難治組治療前的優勢菌群為厚壁菌門，治療后優勢菌群為厚壁菌門和擬桿菌門。藥物難治組治療前的F/B值高于藥物反應組和對照組（P＜0.05）。

2.3 藥物反應組、藥物難治組、對照組屬水平優勢菌及差異組成分析結果藥物難治組治療前前10位優勢菌屬分別為：梭菌屬（Clostridium）、擬桿菌屬（Bacteroides）、克羅諾桿菌（Cronobacter）、多枝梭菌（Erysipelatoclostridium）、瘤胃球菌屬（Ruminococ?cus）、普氏菌屬（Prevotella）、糞桿菌屬（Faecalibacte?rium）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、勞特菌屬（Blautia）、阿克曼菌（Akkermansia），占比分別為30.56 %、15.16%、9.56%、7.73%、5.13%、4.92%、4.83%、4.78%、1.32%、0.78%；治療后前10位優勢菌屬菌群分別為擬桿菌屬、梭菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、阿克曼菌、普氏菌屬、瘤胃球菌屬、克羅諾桿菌、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides）、多枝梭菌，占比分別為34.12%、12.16%、9.97%、9.02%、6.92%、6.59%、4.71%、4.70%、1.42%、0.85%。藥物反應組治療前前10位優勢菌屬菌群分別為擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、普氏菌屬、雙歧桿菌屬、多枝梭菌、勞特氏菌屬、糞桿菌屬、克羅諾桿菌、狄氏副擬桿菌，占比分別為38.35%、11.28%、8.12%、7.72%、7.18%、4.78%、4.57%、3.28%、2.83%、1.02%；治療后前10位優勢菌屬菌群分別為擬桿菌屬、普氏菌屬、瘤胃球菌屬、雙歧桿菌屬、糞桿菌屬、梭菌屬、克羅諾桿菌、阿克曼菌、考拉桿菌屬（Phascolarctobacte?rium）、勞特氏菌屬，占比分別為40.89%、11.67%、10.82%、8.34%、5.48%、3.02%、2.91%、2.19%、1.42%、0.98%。對照組菌群前10位優勢菌屬分別為擬桿菌屬、糞桿菌屬、雙歧桿菌屬、普氏菌屬、克羅諾桿菌、瘤胃球菌屬、勞特菌屬、羅斯菌屬（Rose?buria）、狄氏副擬桿菌、梭菌屬，占比分別為39.32%、12.38%、12.21%、7.15%、6.17%、3.12%、2.62%、1.76%、1.38%、1.15%。

藥物反應組治療前后優勢菌群差異不大，優勢菌群為擬桿菌屬、瘤胃球菌屬和普氏菌屬（t=1.502、P＞0.05；t=1.383，P＞0.05、t=6.751，P＜0.05）。藥物難治組治療前后優勢菌群差異較大，治療后豐度增加的菌屬有擬桿菌屬、雙歧桿菌屬及阿克曼菌（t分別為58.587、8.179、16.463，P均＜0.05），減少的有梭菌屬、克羅諾桿菌及多枝梭菌（t分別為22.635、10.999、21.827，P均＜0.05）。

治療前，與對照組、藥物反應組比較，藥物難治組豐度多的菌屬有梭菌屬（F=1359.239，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為52.08、36.76、14.55，P均＜0.05）和克羅諾桿菌（F=118.411，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為8.26、15.17、9.60，P均＜0.05），豐度少的菌屬有擬桿菌屬（F=479.032，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為29.70、26.37、1.41，藥物反應組與對照組間比較，P＞0.05，余兩兩組間比較，P均＜0.05）和雙歧桿菌屬（F=99.262，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為12.64、3.79、10.09，P均＜0.05）。治療后，與對照組、藥物反應組比較，藥物難治組治療前原有豐度多的菌屬如梭菌屬仍有差異（F=579.246，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為33.74、25.91、6.76，P均＜0.05），原有豐度少的菌屬如擬桿菌屬（F=12.723，P＜0.05；兩兩組間比較，t分別為4.53、5.45、1.61，藥物反應組與對照組間比較，P＞0.05，余兩組間比較，P均＜0.05）和雙歧桿菌屬（F=27.557，P＜0.05；兩兩 組間 比較，t分別 為3.61、2.43、7.35，P均＜0.05）亦仍有差異。

3 討論

腸道菌群作為一大類微生物群主要定植于人體消化道中，數目多、類別豐富，與宿主的免疫系統發生一系列動態相互作用，有助于維持代謝動態平衡，維生素B的合成，改善消化，促進血管生成和神經功能［7-8］。人體腸道定植約104數量級的細菌叢，其細胞總數大約是人體自身細胞的10倍，根據細菌16 S rRNA序列分類，腸道細菌有500～1 000種，主要由厚壁菌門（如Ruminococcus，Clostridium，Eubacte?ria）、擬桿菌門（如Porphyromonas，Prevotella）、放線菌門（如Bifidobacterium）等組成［8-9］。本研究亦證實不管是正常健康患兒還是癲癇患兒，其腸道菌群均主要由厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門等組成，只不過優勢菌群各有不同。

“腸腦軸”是指胃腸和中樞神經系統之間的雙向相互作用。較多研究表明，神經系統疾病與腦腸軸失衡有關［4］，大腦可能通過免疫系統、神經系統、內分泌系統調控胃腸道功能，而腸道菌群可能通過迷走神經、神經遞質（如5-羥色胺、多巴胺）、神經營養因子（如腦源性神經營養因子）等影響大腦功能。既往研究發現，腸道菌群和大腦之間有五種可能的交流途徑，其中包括神經連接、下丘腦—垂體—腎上腺軸、腸道細菌合成的神經遞質、腸道免疫系統以及腸黏膜屏障與血腦屏障之間的相互連接［10］。藥物難治性癲癇患者約占全球癲癇患者總數的三分之一，其耐藥性的病理生理機制尚未完全闡明；然而，目前的證據表明，腸道生態失調可能是致病因素之一［11］。本研究發現，與健康患兒及藥物反應性癲癇患兒相比，藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群多樣性顯著增高，稀有微生物群的豐度增加，與PENG等［12］研究結果一致。但XIE等［13］研究發現藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群多樣性是下降的；LINDEFELDT等［14］研究顯示藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群多樣性沒有顯著差異，與本研究結果不一致。筆者分析三個研究結果不一致的原因考慮與研究對象年齡差異有關，因為腸道微生物組成在很大程度上顯示出年齡依賴性［10］，故藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群的多樣性變化尚需進行大樣本的研究。既往多數研究［12-14］均提示藥物難治性癲癇患兒的厚壁菌門增多，擬桿菌門下降，F/B顯著升高。本研究結果顯示，與健康患兒及藥物反應性癲癇患兒相比，藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群F/B升高，與文獻報道相似。F/B是衡量整個腸道微生物平衡的重要指標，藥物難治性癲癇患兒的腸道菌群F/B顯著升高提示其腸道微生物失衡。

藥物反應組癲癇患兒抗癲癇治療前后腸道優勢菌門差異不大，優勢菌群以擬桿菌門為主，與健康患兒相仿。藥物難治組癲癇患兒抗癲癇治療前后腸道優勢菌門差異較大，治療前以厚壁菌門占優勢，治療后變為厚壁菌門與擬桿菌門均占優勢。藥物難治組與對照組、藥物反應組治療前腸道菌群的菌屬比較，豐度多的菌屬有梭菌屬和克羅諾桿菌，豐度少的菌屬有擬桿菌屬和雙歧桿菌屬。梭菌屬能夠通過發酵糖和蛋白產生有機酸和醇類，屬內多個菌種可以產生毒素，含量過高可引發炎癥，而炎癥參與癲癇發展，炎癥和癲癇之間的因果關系是相互的［15-18］。雙歧桿菌豐度減少的一個結果可能是短鏈脂肪酸的產生減少，特別是乙酸鹽和丁酸鹽。丁酸鹽能保護原代神經元和神經母細胞瘤細胞免受氧化損傷。乙酸和丁酸是短鏈脂肪酸的組成部分，短鏈脂肪酸是腸道陰離子的主要存在形式，能被腸上皮細胞迅速吸收。短鏈脂肪酸對哺乳動物產生多種有益作用，如免疫調節和能量消耗，短鏈脂肪酸也可能有助于調節大腦中小膠質細胞的成熟和功能。由于短鏈脂肪酸的神經活性及其對其他腸腦信號通路的影響，短鏈脂肪酸可能直接或間接地通過微生物群—腸—腦軸參與交流。LEE等［19］發現，雙歧桿菌群可作為癲癇相關腸道微生物組的潛在生物標志物之一。因此，雙歧桿菌屬可能可作為判斷癲癇治療效果的潛在生物標志物，其減少不利于癲癇的治療，提示在抗癲癇的治療中補充雙歧桿菌屬是有益的。

綜上所述，藥物難治性癲癇患兒存在腸道菌群失調，腸道菌群多樣性及稀有性細菌增多。腸道菌群與癲癇存在關聯，我們有可能通過改變腸道微生物群，從而治療癲癇［20］。由于藥物反應性和難治性癲癇患者的腸道菌群組成存在顯著差異，腸道微生物的差異可能用以預測癲癇患者的預后和評估藥物治療反應。但目前仍缺乏抗癲癇藥物與腸道微生物群直接相互作用的證據。一項體外研究顯示，拉莫三嗪可抑制大腸桿菌中核糖體的產生［21］，一項動物研究表明，氯硝西平可被腸道菌群代謝［22］，未來需要對抗癲癇藥物與腸道微生物群相互作用的影響進行更深入的研究。