最低抑菌濃度法在耐藥結核分枝桿菌藥敏試驗中的應用

吳敏，周洪經，李志媛，張秀雯，孫海柏，張麗霞，陳懷永

1天津市海河醫院，天津300350；2國家中醫藥管理局中醫藥防治傳染病重點研究室

結核病是全球范圍內致死的十大原因之一，每年有數百萬人患上結核病。據世界衛生組織估算，2017年全球結核病潛伏感染人群約為17億，中國估算結核病新發患者數為88.9萬，估算結核病發病率為63/10萬，在30個結核病高負擔國家中估算結核病發病率排第28位。估計2017年全球有55.8萬人為耐利福平結核?。≧R-TB），而這些人中有82%為多重耐藥結核?。∕DR-TB）［1-4］?？菇Y核一線藥物鏈霉素（SM）、異煙肼（INH）、利福平（RIF）、乙胺丁醇（EMB）有強殺菌作用，價格低廉，不良反應少，可口服，是治療肺結核的基本用藥之一；相對于一線藥物來說，抗結核二線藥物卷曲霉素（CPM）、卡那霉素（KAN）、氧氟沙星（OFX）、對氨基水楊酸（PAS）臨床療效較差，毒性較大，主要用于對一線抗結核藥物不耐受者，一旦出現不良反應應立即停止服藥。因此，正確的抗結核藥物的選擇對結核病的治療起關鍵作用。目前檢測抗結核菌藥物敏感性實驗的金標準為改良羅氏比例法，它可以檢測SM、INH、RIF、E 4種抗結核一線藥物和CPM、KAN、OFX、PAS 4種二線藥物，但檢測藥物種類固定，且周期長。最低抑菌濃度法（MIC法）是一種比較新的藥敏檢測方法，可以檢測4種一線抗結核藥物和10種二線抗結核藥物［SM、INH、RFP、EMB、左氧氟沙星（Lfx）、阿米卡星（Am）、CPM、丙硫異煙胺（Pto）、力克肺疾（PI）、莫西沙星（Mfx）、Pas、利福布?。≧fb）、卡那霉素（KAN）、氯法齊明（Cfz）］，其操作簡便，報告時間快，且準確率高［5-7］。本研究采用MIC法藥敏試驗檢測129例分枝桿菌培養陽性菌株，并以改良羅氏比例法藥敏試驗為金標準作對照，分析MIC法檢測抗結核藥物的準確性和符合率。

1 材料與方法

1.1 菌株、試劑及儀器 選取天津市海河醫院2019年6—8月結核科住院患者和門診患者培養分枝桿菌陽性菌株129份（參照結核分枝桿菌抗原檢測方法，即取1 mg/mL菌液100μL滴到檢測的樣本滴下部，15 min后觀察檢測板的判定部；檢測線及質控線雙方都確認出現紫紅色條帶判定為陽性，提示樣本中有結核菌的存在；檢測線處沒有出現紫紅色條帶，只在質控線出現紫紅色條帶判定為陰性）。MIC分枝桿菌藥敏檢測試劑盒（培養法）購自珠海市銀科醫學工程股份有限公司，羅氏培養基和含藥羅氏培養基均購自杭州創新生物檢控技術有限公司結核分枝桿菌抗原檢測試劑盒（膠體金法）購自杭州創新生物檢控技術有限公司，標本前處理液2%N-乙酰-L半胱氨酸-NaoH消化液（2%NaoH-NALC）購自珠海貝索生物科技股份有限公司。電熱恒溫培養箱購自上海森信實驗儀器有限公司，超聲比濁儀購自廣東體必康生物科技有限公司。

1.2 結核分枝桿菌的分離培養 患者標本采用NALC法消化液前處理，取1～3 mL標本于50 mL離心管中，加入2倍體積的前處理液消化震蕩15 s液化，靜置15 min，加入無菌生理鹽水至45 mL，然后以4 000 r/min速度離心20 min，棄去上清，在沉淀中加入1 mL的無菌生理鹽水，震蕩重懸，取100μL接種改良羅氏培養基2支，放置37℃恒溫培養箱培養。3 d觀察有無污染，以后每周觀察1次，2～3周后出現可見菌落可用于藥敏檢測［8］。

1.3 結核分枝桿菌的改良羅氏比例法藥敏試驗 取分枝桿菌陽性菌株，用一次性接種環取部分菌落至含2 mL生理鹽水的超聲比濁管中，調菌液濃度為1 mg/mL，分別取高稀釋度（10-4）菌液一環，劃線接種空白對照培養基和含藥培養基（SM 4μg/mL、INH 0.2μg/mL、RFP 40μg/mL、EMB 2μg/mL、CPM 40μg/mL、PAS 1μg/mL、OFX 2μg/mL、KAN 30μg/mL）；然后分別取低稀釋度（10-2）菌液一環，劃線接種空白對照培養基和含藥培養基，37℃恒溫培養箱培養，4周后觀察結果。質控菌株H37RV作為全敏感標準菌株，由天津市疾病控制中心提供。計算耐藥百分比，耐藥百分比=含藥培養基上生長的菌落數/對照培養基生長的菌落數×100%，若耐藥百分比≥1%，則判斷為耐藥［8］。

1.4 結核分枝桿菌的MIC法藥敏試驗 分離獲得處于對數生長期的結核分枝桿菌，磨菌比濁至1 mg/mL。取出凍干雜菌抑制劑，將無菌稀釋液全部加入后充分搖勻。取出藥敏培養基及藥敏測試板，吸取100μL混合均勻的雜菌抑制劑加入藥敏培養基，充分混勻。用無菌吸嘴先分別吸取180μL藥敏培養基加入到A1或E1、B1或F1，分別作為1/10、1/100參照孔。用無菌吸嘴吸取200μL藥敏培養基加 入 到C1、D1或G1、H1作 為 陰 性 參 照 孔。取100μL菌液（1 mg/mL）加入到整支藥敏培養基中混勻。每孔加200μL含有菌液的藥敏培養基（除上述4孔），再吸20μL至A1或E1孔作為1/10參照孔，從A1或E1孔吸20μL至B1或F1作為1/100參照孔，蓋上盒蓋，用透明膠帶沿周邊封一圈后，置37℃培養，7～10 d后觀察結果?？椎壮霈F白色菌體沉淀為陽性［9］，利用微生物常規藥敏試驗掃描系統可直接得到藥敏結果。耐藥判斷標準（最佳臨界值）：SM 4μg/mL，INH 0.2μg/mL，RFP 4μg/mL，EMB 2.5μg/mL，Lfx 2μg/mL，Am 1μg/mL，CPM 2.5μg/mL，Pto 10μg/mL，PI 0.5μg/mL，Mfx 0.5μg/mL，Pas 2μg/mL，Rfb 0.75μg/mL，KAN 2.5μg/mL，Cfz 2μg/mL。

1.5 微量MIC法在結核分枝桿菌藥敏檢測中準確性評估 以改良羅氏比例法藥敏實驗為金標準，通過計算敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值及其診斷符合率，以評價微量MIC法再分枝桿菌藥敏檢測中的準確性。

2 結果

改良羅氏比例法藥敏試驗結果：對于SM敏感菌有100株，耐藥菌有29株；對于INH敏感菌有101株，耐藥菌有28株；對于RFP敏感菌有109株，耐藥菌有20株；對于EMB敏感菌有118株，耐藥菌有11株；對于KAN敏感菌有124株，耐藥菌有5株；對于氨基水楊酸敏感菌有125株，耐藥菌有4株；對于OFX敏感菌有108株，耐藥菌有21株；對于CPM敏感菌有125株，耐藥菌有4株。

MIC法藥敏試驗結果對于SM敏感菌有103株，中敏菌有4株，耐藥菌有22株；對于INH敏感菌有102株，中敏菌有0株，耐藥菌有27株；對于RFP敏感菌有109株，中敏菌有1株，耐藥菌有19株；對于EMB敏感菌有117株，中敏菌有9株，耐藥菌有3株；對于左氧氟沙星敏感菌有112株，中敏菌有15株，耐藥菌有2株；對于阿米卡星敏感菌有124株，中敏菌有0株，耐藥菌有5株；對于CPM敏感菌有123株，中敏菌有6株，耐藥菌有0株；對于Pto敏感菌有127株，中敏菌有2株，耐藥菌有0株；對于PI敏感菌有116株，中敏菌有8株，耐藥菌有5株；對于莫西沙星敏感菌有111株，中敏菌有11株，耐藥菌有7株；對于對氨基水楊酸敏感菌有121株，中敏菌有4株，耐藥菌有4株；對于Rfb敏感菌有114株，中敏菌有14株，耐藥菌有1株；對于KAN敏感菌有116株，中敏菌有8株，耐藥菌有5株；對于氯法齊明敏感菌有128株，中敏菌有0株，耐藥菌有1株。

兩種檢測方法中，有7種藥物為其共有，以改良羅氏比例法藥敏試驗檢測為金標準，MIC法中敏菌和耐藥菌合并為一組數據，通過計算靈敏度、特異度、陰性預測值、陽性預測值及其診斷符合率結果表明；對于SM藥敏檢測的靈敏度為100.0%，特異度為97.1%，陽性預測值為89.6%，陰性預測值為100.0%，診斷符合率為97.7%；對于INH藥敏檢測的靈敏度為96.3%，特異度為98.0%，陽性預測值為92.8%，陰性預測值為99.0%，診斷符合率為97.7%；對于RFP藥敏檢測的靈敏度為95.0%，特異度為99.1%，陽性預測值為95.0%，陰性預測值為99.1%，診斷符合率為98.4%；對于EMB藥敏檢測的靈敏度為83.3%，特異度為99.1%，陽性預測值為90.9%，陰性預測值為98.3%，診斷符合率為97.7%；對于KAN藥敏檢測的靈敏度為38.5%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為93.5%，診斷符合率為93.8%；對于氨基水楊酸藥敏檢測的靈敏度為50.0%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為96.8%，診斷符合率為96.9%；對于CPM藥敏檢測的靈敏度為66.6%，特異度為100.0%，陽性預測值為100.0%，陰性預測值為98.4%，診斷符合率為98.4%。

3 討論

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的慢性傳染病，當結核分枝桿菌侵襲數量達到一定程度，大于機體免疫力抵抗時容易引起疾?。?0］，結核菌可能侵犯人體各種器官，但主要侵犯肺臟，引起肺結核病，呼吸道是其傳播主要途徑。傳染源是接觸排菌的肺結核患者，臨床上多呈慢性過程，常伴有低熱、乏力等全身中毒癥狀和咳嗽、咯血等呼吸系統表現，常用結核菌素皮膚試驗（TST）進行篩查［11］。免疫力低下人群例如艾滋病、糖尿病患者更容易罹患該?。?2-13］，其他部位（頸淋巴、腦膜、腹膜、腸、皮膚、骨骼）也可繼發感染引起肺外結核［14］。2021年是開啟“十四五”規劃的第一年，距離實現聯合國“2030年可持續發展議程”結核病控制目標和“2035年終止結核病流行”目標，只剩下10年和15年的時間，也將是結核病防治邁上新臺階的一年［15］。結核分枝桿菌是引起人類結核病的主要病原菌，是專性需氧的一類細菌，抗酸染色陽性，無鞭毛，有菌毛，有微莢膜但不形成芽孢，其細菌壁既沒有革蘭陽性菌的磷壁酸，也沒有革蘭陰性菌的脂多糖，細長略帶彎曲的桿菌，大小1～4×0.4μm。初次分離需要營養豐富的培養基。常用的有羅氏固體培養基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等。孔雀綠可抑制雜菌生長，便于分離和長期培養。蛋黃含脂質生長因子，能刺激生長。根據接種菌多少，一般2～4周可見菌落生長。菌落呈顆粒、結節或花菜狀，乳白色或米黃色，不透明。作為胞內致病菌，結核分枝桿菌在宿主細胞內潛伏或增殖，其不僅能被宿主吞噬細胞所吞入，還可入侵以造血干細胞和間充質干細胞為代表的干細胞［16］。

在我國結核菌藥敏檢測曾用絕對濃度法，但該方法對混懸液制備、接種量的要求非常嚴格，對操作者的技術要求較高，且此法未對“耐藥”“敏感”進行明確定義。因此，改進后羅氏比例法藥敏檢測被WHO推薦為金標準，可對藥物靈敏度試驗中的接種量進行校正，通過配置1麥氏單位標準濃度菌液，進行百倍稀釋和萬倍稀釋后接種含藥培養基，通過計數生長菌落數直觀的判定敏感、耐藥。同時檢測四種抗結核一線藥物SM、INH、RFP和EMB和四種二線藥物CPM、KAN、OFX和PAS，4周后觀察結果［17］。依據所得藥敏結果，將結核病患者耐藥分為以下四種。單耐藥：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實對一種一線藥物抗結核藥物耐藥。多耐藥：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實對不同時包括INH、RFP在內的一種以上的一線抗結核藥物耐藥。耐多藥（MDR-TB）：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實至少對INH、RFP耐藥。嚴重耐多藥（XDR-TB）：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實除了至少對兩種主要一線抗結核藥物INH、RFP耐藥外，還對任何氟喹諾酮類抗生素（如氧氟沙星）產生耐藥，以及三種二線抗結核注射藥物（如CPM、KAN、丁胺卡那霉素等）中的至少一種耐藥。耐多藥結核病患者一般至少需要24個月的治療，重癥患者可能需要36個月的治療，但治愈率僅為50%～60%。這使得耐多藥結核病的經濟負擔比非耐多藥結核病病例高出10～100倍。而使用二線藥物治療耐多藥結核病需要更長的時間，因為二線藥物更昂貴，副作用更多。因此，控制結核病多藥耐藥病例的比例，是我國公共衛生工作的重中之重［18-19］。

表型檢測方法為金標準，但檢測周期較長且藥物種類受限，目前只包括8種抗結核藥物。我們選擇MIC法的優點為檢測所需時間較短，操作簡便，所需儀器設備簡單，可同時檢測多種抗結核藥物，滿足臨床需求，同時還可以得到菌株的MIC值，更有利于指導臨床用藥［5］。SCH?N等［20］研究表明，適用于大多數細菌病原體的MIC檢測標準也應適用于結核分枝桿菌復合體。MIC試驗不同于常規藥敏試驗在單一臨界濃度下的藥敏試驗，它能定量地反映耐藥情況。研究［21］發現，氟喹諾酮類藥物的MIC值增加與糖尿病、年齡＞40歲與治療失敗顯著相關，與耐多藥肺結核患者治療失敗相關。劉金娜［22］研究表明，微量液體培養基MIC法應用于結核分枝桿菌藥敏試驗中與羅氏比例法有著良好的一致性，且檢測速度快，經濟適用性好。馬小華等［23］發現，采用基因芯片法進行NTM菌種鑒定，對不同類型菌種進行歸類，并采用微量稀釋法進行NTM藥物敏感試驗，依據CLSI標準判斷結果，計算藥物對細菌的MIC50和MIC90值，分析藥敏結果可以為臨床治療提供理論依據。本研究利用結核分枝桿菌MIC法和羅氏比例法藥敏檢測試劑盒檢測抗結核藥物靈敏度，比例法結果表明各種藥物耐藥率分別為SM 22.5%、INH 21.7%、RFP 15.5%、EMB 8.5%、KAN 3.9%、PAS3.1%、OFX 16.3%、CPM3.1%；MIC法 檢 測 結 果 為SM 20.2%、INH 20.9%、RFP 15.5%、EMB 9.3%、KAN 10.1%、PAS 6.2%、LFX 13.2%、MFX 14.0%、CPM 4.7%；兩種方法檢測結果較一致。其他抗結核藥耐藥率檢測結果為Cfz 0.8%、Pto 1.6%、PI 10.1%、Rfb 11.6%、AM 3.9%。與比例法藥敏結果相比，MIC檢測SM、INH、RFP、EMB、KAN、PAS、CPM藥物的符合率較高，分別為97.7%、97.7%、98.4%、97.7%、93.8%、96.9%、98.4%。在耐藥性檢測方面，以傳統比例法為金標準，MIC法對于一線藥物耐藥檢測的靈敏度和特異度都較高，對于二線藥物檢測靈敏度較低，這可能與藥物作用機制不同有關，可以進一步做藥物機制研究的臨床驗證。