低濃度二甲雙胍對肝癌細胞株Huh-7遷移、侵襲能力的影響及其機制

殷威達，吳秋秋，劉一帆，劉季芳，陳紀濤

廣州醫科大學附屬第五醫院，廣州510700

世界范圍內肝癌（HCC）發病率位居惡性腫瘤的第五位，病死率高居第三位［1］。我國每年大約40萬人死于HCC，占全球HCC死亡總數的51%［2］，給社會和家庭帶來沉重負擔。目前，HCC首選、最有效的治療方法是手術切除，但該病早期無典型癥狀，一旦確診往往處于晚期，肝功能受損嚴重，耐受性差，導致大部分患者失去手術機會［3］。即使HCC患者獲得根治性切除，5年內仍有60%～70%的患者出現復發轉移［4］。此外HCC對放、化療均不敏感，總體來說患者預后仍不理想。哺乳動物中丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）通過磷酸化丙酮酸脫氫酶復合物（PDC）的活性，進而啟動Warburg代謝進程促進腫瘤細胞的異常增殖，作為4種異構體之一的PDK4在調控PDC蛋白物質代謝中扮演著靶標的角色［5-6］。文獻［7-9］報道，藥物通過調節PDK4的表達調控PDC，進而影響糖代謝和脂代謝，HCC細胞主要利用糖酵解作為能量來源，而糖、脂代謝對于腫瘤的增殖異常重要。二甲雙胍作為一種經典的治療Ⅱ型糖尿病藥物，前期研究發現低濃度二甲雙胍通過誘導HCC細胞衰老抑制其增殖［10-11］。最近體外研究也發現，PDK4表達缺失促進HCC細胞增殖、致瘤性和侵襲轉移［12］，敲低PDK4能夠上調關鍵脂肪生成酶的表達促進HCC細胞的增殖和遷移［13］。但二甲雙胍能否通過調控PDK4蛋白表達抑制其增殖和遷移、侵襲目前尚未報道。2020年7—10月，我們觀察了低濃度二甲雙胍對HCC細胞侵襲、轉移能力的影響，并探討其機制，旨在為HCC的治療提供新的理論基礎及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株、試劑及儀器HCC細胞Huh-7購自中國科學院細胞庫。二甲雙胍鹽酸鹽（Sigma公司），Transwell 24孔板、Matrigel基質膠（Corning公司），PDK4抗體（Abcam公司）。多功能酶標儀（美國，BioTEK），細胞計數儀（美國，Countstar IC-1000）、倒置熒光顯微鏡（德國，Leica），正置熒光顯微鏡（德國，Leica）、化學發光成像系統（美國，ChemiDoc XRS+），Western blot系統（美國，Bio-Rad）。

1.2 二甲雙胍干預后的Huh-7細胞遷移率測算 采用細胞劃痕實驗。取對數生長期的Huh-7細胞，以胰酶消化，用含10%FBS的DMEM高糖培養基終止消化，再均勻鋪到六孔板中，六孔板背面畫上5條相互平行的橫線，放入細胞培養箱培養過夜。次日細胞長滿后再將培養基棄去，用PBS清洗3遍，用200μL槍頭沿著直尺垂直橫線分別劃各孔細胞，再用PBS清洗劃痕處漂浮的細胞，各孔分別加入1和0 mmol/L二甲雙胍（分別記為觀察組和對照組），再放入37℃、5%CO2細胞培養箱培養48 h，分別于24、48 h時用倒置顯微鏡拍照，計算遷移率。

1.3 二甲雙胍干預后的Huh-7細胞侵襲細胞數計算 采用細胞侵襲（Transwell）實驗。用無血清DMEM培 養 基 將 基 質 膠 稀 釋 至200μg/mL，將100μL基質膠緩慢加入Transwell小室，37℃培養箱中培養2 h。將對數生長期的Huh-7細胞分別用1和0 mmol/L二甲雙胍處理24 h（分別記為觀察組和對照組），用胰酶消化后細胞計數，用無血清DMEM高糖培養基稀釋至5×105個/mL，加200μL在各小室，再分別在下室各孔中分別加入750μL含10% FBS的DMEM高糖培養基，十字搖勻，放細胞培養箱培養24 h。用無菌棉簽拭去基質膠和小室未侵襲的細胞，各下室棄去培養基后用PBS清洗3次，加入4%多聚甲醛固定20 min。再棄去多聚甲醛，用PBS清洗2次，再加入1%結晶紫染色40 min。PBS洗去小室多余結晶紫后，在正置顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野進行拍照，計算侵襲細胞數。

1.4 二甲雙胍干預后的Huh-7細胞PDK4 mRNA檢測 采用葡萄糖代謝芯片。將處于對數生長期的Huh-7細胞分別用無血清DMEM高糖培養基配制成的1、0 mmol/L二甲雙胍處理24 h（分別記為觀察組和對照組），送到上海康成生物科技有限公司做葡萄糖代謝芯片，通過用TRIzol法提取總RNA，經過檢測、純化、探針雜交等步驟，對葡萄糖代謝芯片的數據進行差異表達和功能富集分析，評估二甲雙胍對PDK4 mRNA表達的影響。

1.5 二甲雙胍干預后的Huh-7細胞PDK4蛋白檢測 采用蛋白免疫印跡實驗。取對數生長期Huh-7細胞，分別用1、0 mmol/L二甲雙胍處理24 h，加入裂解液，裂解完轉至離心管，4℃下以12 000 r/min的速度離心20 min，取部分上清用BCA法測蛋白濃度，剩余上清加入5×Loading buffer，煮10 min蛋白變性后-20℃保存。上樣電泳：冰上操作，根據蛋白濃度上樣，上樣量為50μg，80 V電泳，條帶分開和樣品壓成直線時調為120 V，條帶跑到電泳槽底部終止電泳。轉膜：轉膜槽保持低溫，100 V轉膜120 min。封閉：5%脫脂牛奶中封閉2 h。敷一抗：根據蛋白分子量剪膜，加入根據抗體說明書稀釋好的一抗，4℃冰箱搖床過夜。敷二抗：回收一抗，洗膜3次后再加入BSA稀釋好的二抗，室溫搖床孵育1 h。顯影：洗膜3次，打開Image Lab系統，加入顯影劑曝光，檢測PDK4蛋白。

1.6 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞遷移率、侵襲數比較 觀察組干預24、48 h細 胞 遷 移 率 分 別 為40.14%±2.40%、84.02%±3.85%，對 照 組 分 別 為100.00%±0.00%、170.10±7.48%，兩組比較，P均＜0.05。觀察組干預24 h細胞侵襲數為（183.20±17.13）個，對照組為（403.60±17.31）個，兩組比較，P＜0.05。

2.2 兩組PDK4 mRNA、蛋白相對表達量比較 觀察組及對照組PDK4 mRNA相對表達量分別為1±0.01、1.84±0.01，兩組比較，P＜0.05。觀察組及對照組PDK4蛋白相對表達量分別為0.53±0.01、0.44 ±0.01，兩組比較，P＜0.05。

3 討論

2020中國臨床腫瘤學會（CSCO）HCC治療指南數據顯示，全球每年HCC新發病例一半以上來自中國；在中國范圍內，HCC位居惡性腫瘤的第四位，致死率高居第二位，嚴重威脅著國民的健康，給家庭和社會帶來沉重的負擔。HCC的治療手段主要有手術、放化療、介入、免疫和靶向治療，雖然取得了很大的進步，極大地改善了患者的預后，但5年生存率仍不盡人意［14-15］。目前，治療HCC療效最好的治療手段是手術切除和肝移植，但早期無明顯癥狀體征、疾病進展快、易肝內外轉移、癌栓侵犯大血管等因素嚴重制約手術開展［16］。如果能抑制HCC細胞向遠處轉移，對于增加手術切除機會提高患者生存率具有重要意義［17］。臨床工作中我們發現，慢性肝炎極易損傷肝臟組織，導致患者肝功代謝異常引起肝硬化，嚴重時可使肝細胞發生癌變，導致HCC的發生。能量代謝異常是實體瘤細胞的基本特征之一，因此從逆轉HCC代謝重編程的角度去探討，對于HCC的治療具有十分重要的意義。

代謝方式的改變對于腫瘤的發生發展至關重要，丙酮酸脫氫酶激酶家族在腫瘤發生中起關鍵作用。PDK4作為4種丙酮酸脫氫酶激酶亞型之一，是糖酵解和氧化磷酸化途徑的關鍵酶，調控整個代謝網絡使其適合腫瘤的生長［18］。最新研究發現，PDK4基因敲除可以增強HCC細胞的增殖能力，促進HCC細胞遷移、侵襲［12］。YANG等［13］亦發現，敲低PDK4明顯增加脂肪合成關鍵酶如脂肪酸合成酶（FASN）和硬脂酰輔酶A去飽和酶（SCD）的表達，最終誘導脂肪生成，同時促進HCC細胞的增殖和侵襲遷移，據此推測PDK4可能通過下調脂肪生成來抑制HCC細胞的增殖和遷移侵襲能力。在接受多模式治療的轉移性HCC患者中，上調PDK4表達可降低肝化療誘導的氧化應激，并與術后肝功能改善相關［19］。這些發現表明，PDK4表達缺失可促進HCC的惡性進展從而影響臨床預后，上調PDK4則有助于改善HCC患者預后，而PDK4也被發現在肺癌、卵巢癌、子宮內膜癌中起到抑癌作用［20-22］。腫瘤抑制因子在癌癥中經常被下調，我們進一步查詢The Human Protein Atlas和Gepia Cancer兩個數據庫，體內實驗結果發現HCC組織中PDK4蛋白低表達，HCC中PDK4表達升高的患者，5年生存率顯著提高。以上體內外實驗結果提示，PDK4蛋白表達可能與HCC肝內外轉移密切相關。

本課題組前期研究中葡萄糖代謝芯片結果發現，低濃度二甲雙胍處理HCC Huh-7細胞后，與對照組相比，PDK4 mRNA的表達明顯升高。而PDK4蛋白表達又和HCC細胞遷移、侵襲密切相關，那是否低濃度二甲雙胍能夠通過上調該蛋白的表達抑制其轉移能力？我們分別采用細胞劃痕和Transwell兩種經典實驗方法驗證，結果發現低濃度二甲雙胍確實抑制HCC細胞的遷移、侵襲。為進一步驗證二甲雙胍通過調控PDK4抑制HCC細胞遷移、侵襲能力，接下來我們采用1 mmol/L二甲雙胍處理HCC細胞，實驗結果證實其能夠顯著上調PDK4蛋白表達。但在HCC中，二甲雙胍通過調控PDK4蛋白抑制其侵襲的具體機制，目前還需進一步闡明。

總之，二甲雙胍能抑制HCC Huh-7細胞的遷移和侵襲，機制可能與其可調控PDK4蛋白表達有關。PDK4有望成為抑制肝癌侵襲轉移的新靶點，為肝癌的靶向治療提供新的研究方向。