白皮杉醇對過氧化氫誘導的血管平滑肌細胞凋亡的影響與機制

李文娣 吳雷琪 黃全忠

動脈粥樣硬化(atherosclerosis， As)是機體對血管內皮細胞損傷的一種慢性反應[1]，As 的發病機制與氧化應激損傷、血脂代謝紊亂、炎癥反應等密切相關[2]。 AS 損傷的各時期均存在細胞凋亡，而斑塊中凋亡的細胞包括血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells， VSMCs)。 VSMCs 是血管壁的主要成分，其結構和功能的異常可導致成熟AS 斑塊不穩定以及心腦血管疾病的發生發展[3-4]，而VSMCs 的過度增殖和凋亡是造成動AS 發生病變的關鍵因素。

白皮杉醇(piceatannol，PCT)是一種具有較強抗氧化活性的多酚物質，可以清除自由基，提高機體免疫力[5]。 有研究證實，PCT 還具有抑制炎癥反應與抵抗細胞凋亡的作用[6]，并且能夠抑制腫瘤細胞的生長，降低癌癥的發生率[7-8]。 而關于白皮杉醇在抑制AS 進展及預防介入治療心血管疾病的研究卻不多。 本文以過氧化氫(hydrogen peroxide， H2O2)為凋亡誘導劑，觀察白皮杉醇對H2O2誘導的VSMCs 凋亡的影響及相關凋亡蛋白的表達變化，探討其抗凋亡機制。

材料與方法

1.動物 健康，雄性Sprague-Dailey 大鼠，15只，體質量平均(100±10)g，購于北京生命科學研究所，動物許可證號:SYXK(京)2018-0022。

2.試劑 白皮杉醇(PCT，＞98%)，DMEM，FBS和MTT 購于美國Sigma 公司，兔抗Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、eNOS、p-eNOS、

鼠抗β-actin、山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG 等抗體以及Bio-Rad 試劑盒購于美國Millipore 公司，LDH 測定試劑盒，超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒，Annexin V/PI 凋亡試劑盒和Hoechst 33258 均購于碧云天生物技術研究所。 其他試劑為進口分裝或國產分析純。

3.VSMCs 獲取與培養 摘取健康雄性SD 大鼠胸主動脈血管，除去血管中粘連的結締組織和脂肪組織，刮取血管中膜，將其剪成約1 mm×1 mm 組織塊，貼于培養瓶內，于37 ℃，5% CO2條件下用含20% FBS 的DMEM 培養液進行培養，培養液每3 d更換1 次。 待生長至60% ～80%融合時，加入0.25%胰蛋白酶消化傳代。 倒置相差顯微鏡下觀測原代VSMCs 為梭形，長成致密細胞層時出現典型的“峰-谷”狀結構。 實驗中使用第3～8 代細胞。

4.分組與處理 (1)400 μM H2O2處理VSMCs不同時間(1，2，4，8 h)誘導細胞過氧化損傷。

(2)不同濃度H2O2(100，200，400，800 μM)處理VSMCs 2 h 以誘導過氧化損傷。

(3)白皮杉醇(piceatannol，PCT)預處理2 h 后，H2O2繼續處理2 h，具體分為五組:①對照組(control)，VSMCs 正常培養2 h；②H2O2組，VSMCs 在含有400 μM H2O2的培養基中培養2 h；③10 μM PCT＋400 μM H2O2，10 μM PCT 預處理VSMCs 2 h后，400 μM H2O2繼續處理VSMCs 2 h；④20 μM PCT＋400 μM H2O2，20 μM PCT 預處理VSMCs 2 h后，400 μM H2O2繼續處理VSMCs 2 h；⑤40 μM PCT＋400 μM H2O2，40 μM PCT 預處理VSMCs 2 h后，400 μM H2O2繼續處理VSMCs 2 h。

5.MTT 法 將VSMCs 以1×105個/孔的密度接種到96 孔板中，培養24 h。 按1.4 進行不同處理后，離心棄上清，每孔加入20 μL 二苯基溴化四氮唑藍(MTT)溶液，37 ℃孵育4 h，接著加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO)，微量震蕩儀震蕩至生成的藍紫色甲臜完全溶解，于酶標儀570 nm 下測定吸光度(OD)值。

6.LDH 和SOD 測定 LDH 測定:VSMCs 按1.4(3)分組進行相應處理后，吸取培養液，在2 000 r/min，4 ℃下，離心10 min 后，收集上清液按照試劑盒說明進行測定。

SOD 測定:VSMCs 按1.4(3)分組進行相應處理后，加入0.25% 胰蛋白酶消化并收集細胞；2 000轉/min，4 ℃下離心10 min，棄上清；加入1 mL PBS，2000 r/min，4 ℃下離心10 min，重復3 次。 細胞沉淀中加入0.5 mL PBS 溶液，重懸并混勻，在冰水浴條件下研磨細胞，取勻漿液按照試劑盒說明進行測定。

7.Annexin V-PI 檢測 將VSMCs 以2×105個/孔的密度接種到6 孔板，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。 待細胞完全貼壁后，進行以下分組處理:①對照組(control)，VSMCs 正常培養2 h；②H2O2組，400 μM H2O2處理VSMCs 2 h；③PCT 預處理組，40 μM PCT 預處理VSMCs 2 h 后，400 μM H2O2繼續處理VSMCs 2 h。 處理完畢后，用不含EDTA 的胰酶消化并收集細胞，用預冷的PBS 洗滌兩次，加入500 μL 1×Binding Buffer 重懸細胞，在細胞懸浮液加入5 μL Annexin V-FITC，接著加入10 μL PI，室溫避光孵育20 min，立即用流式細胞儀進行檢測，數據用CELL QUEST 軟件分析處理。

8.Hoechst 33258 檢測 將VSMCs 以2×105個/孔接種于6 孔板中，培養24 h。 按1.7 中分三組進行相應處理后，PBS 洗滌兩次，使用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗，加入Hochest 33258 37 ℃避光染色10 min， PBS 洗滌兩次。 在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態的改變。

9.Western blot 檢測 收集按1.4(3)分組處理后的VSMCs，分別加入RIPA 裂解液裂解細胞，提取總蛋白，通過Bio-Rad 試劑盒測定蛋白質的濃度，10%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，切膠并轉移至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入兔抗Bcl-2(1 ∶1 000)，兔抗Bax(1 ∶1 000)，兔抗caspase-3(1 ∶1 000)，鼠抗β-actin(1 ∶5 000)，兔抗PI3K(1 ∶1 000)，兔 抗p-PI3K(1 ∶ 1 000)，兔 抗Akt(1 ∶1 000)，兔抗p-Akt(1 ∶1 000)，兔抗eNOS(1 ∶500)，兔抗p-eNOS(1 ∶500)在4 ℃下過夜。 一抗孵育后，TBST 漂洗PVDF 膜3 次，將PVDF 膜與HRP 標記的山羊抗小鼠IgG 或山羊抗兔IgG 抗體(1 ∶5 000)常溫孵育2 h，TBST 洗膜3 次后，滴ECL 發光液進行曝光，使用Image J 定量分析目標條帶的灰度值。

10.統計學方法 數據采用SPSS 22.0 統計學軟件處理。 計量資料以均數±標準差表示，多組間數據比較采用one-way ANOVA 檢驗，兩兩比較采用LSD-t 檢驗。 以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.H2O2對VSMCs 存活率的影響 VSMCs 經400 μM H2O2的不同時間處理后，與對照組(0 h)比較，H2O2處理1 h 后細胞存活率顯著下降(P ＜0.05)，而處理2 h 后，降至約為50%(P＜0.01)，8 h后＜20%(P＜0.001，圖1A)。 與對照組(0 μM)相比，200 μM H2O2處理使細胞存活率顯著下降(P＜0.01)，400 μM H2O2處理后細胞存活率約為50%(P＜0.01)，而800 μM H2O2處理后細胞存活率僅約為30%(P＜0.001)(圖1B)。 結合以上實驗結果，選擇400 μM H2O2處理2 h 建立VSMCs 損傷模型，進行后續實驗。

2.PCT 對H2O2誘導的VSMCs 存活率的影響VSMCs 經不同濃度PCT 處理2 h 后，細胞活性無變化(圖2 A)。 VSMCs 經不同濃度PCT 預處理2 h后，再加入400 μM H2O2處理2 h(圖2B)，與對照組相比，H2O2組存活率顯著降低(P ＜0.01)；與H2O2組相比，不同濃度PCT 預處理2 h 后均可提高細胞存活率，且呈劑量依賴關系，40 μM PCT 預處理下細胞存活率可恢復到80% 左右(P＜0.01)。

3.PCT 對H2O2誘導的VSMCs 中SOD、LDH 活力的影響 與對照組相比，H2O2組VSMCs 中SOD活力顯著下降(P ＜0.01)；與H2O2組相比，VSMCs經不同濃度PCT 預處理2 h 再加400 μM H2O2處理2 h 后，VSMCs 中SOD 活力顯著升高(P＜0.01)(圖3 A)。 與對照組相比，H2O2組VSMCs 中LDH活力顯著升高(P＜0.01)；用不同濃度PCT 預處理VSMCs 2 h，再加入400 μM H2O2處理2 h 后，與H2O2組相比，PCT 能夠明顯降低LDH 的活力并呈濃度依賴關系(圖3B)。

4.PCT 對H2O2誘導的VSMCs 凋亡的影響結合上述實驗結果，選用40 μM PCT 進行VSMCs的預處理后檢測凋亡情況。 結果表明，與對照組比較，H2O2組VSMCs 凋亡率顯著增加(P＜0.01)；與H2O2組比較，40 μM PCT 預處理后VSMCs 凋亡率則顯著降低(P＜0.01，圖4)。

5.PCT 對H2O2誘導的VSMCs 細胞和細胞核形態的影響 倒置顯微鏡下觀察各組VSMCs(圖5 A)，對照組細胞形態為梭形，細胞密度大，細胞邊界清晰；H2O2組細胞數量明顯減少，細胞形態變得不規則，偽足回縮明顯；40 μM PCT 預處理后能減輕H2O2所致的VSMCs 損傷，可使細胞偽足回縮減輕。

Hoechst 33258 結果顯示，對照組VSMCs 細胞核呈圓形、染色質均勻、邊緣清晰，藍色熒光弱，略見細胞核邊緣不規則的凋亡細胞；H2O2組細胞核固縮，細胞核或細胞質內可見濃染致密的熒光，有細胞核破裂成碎片狀；而40 μM PCT 預處理后明顯改善了VSMCs 的細胞凋亡形態，減少凋亡細胞數量(圖5B)。

圖1 H2O2 對VSMCs 活力的影響 A:400 μM H2O2 處理VSMCs 不同時間后的細胞存活率；B:不同濃度H2O2 處理VSMCs 2 h 后的細胞存活率，注:與對照組相比，*P＜0.05，** P＜0.01， ***P＜0.001

圖2 PCT 對H2O2 損傷VSMCs 活性的影響A:不同濃度PCT 處理VSMCs 2 h 后的細胞存活率；B:不同濃度PCT 預處理VSMCs 2 h，400 μM H2O2 再處理2 h 后的細胞存活率，注:與對照組相比，＃＃ P ＜0.01；與H2O2 組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

圖3 PCT 對H2O2 損傷VSMCs 中LDH、SOD 活力影響 A: 不同濃度PCT預處理VSMCs 2 h，400 μM H2O2 再處理2 h 后VSMCs 中SOD 活力變化；B: 不同濃度PCT 預處理VSMCs 2 h，400 μM H2O2 再處理2 h 后VSMCs 中LDH 活力變化 注:與對照組相比，＃＃P ＜0.01；與H2O2 組相比，* P ＜0.05，**P＜0.01

6.PCT 對H2O2誘導的VSMCs 相關凋亡蛋白的影響 與對照組相比，400 μM H2O2作用2 h 后，VSMCs 中Bax 和caspase-3 的蛋白表達水平顯著增加(P＜0.01)，而Bcl-2 的蛋白表達水平顯著下降(P＜0.01)。 與H2O2組相比，不同濃度PCT 預處理后，Bax、caspase-3 蛋白表達水平隨PCT 濃度增加而逐漸下降(P＜0.01)， Bcl-2 蛋白表達水平卻逐漸增加(P＜0.05 或P＜0.01，圖6)。

7.PCT 對H2O2誘導的VSMCs 中PI3K/Akt/eNOS 信號轉導途徑的影響 與對照組相比，400 μM H2O2處理VSMCs 2 h 后，細胞中p-PI3K、p-Akt 和peNOS 的蛋白表達水平顯著下降(P＜0.01)；與H2O2組相比，不同濃度PCT 預處理2 h 后H2O2再處理，p-PI3K、p-Akt、p-eNOS 的蛋白表達水平逐漸升高，且呈濃度依賴關系(P＜0.05 或P＜0.01，圖7)。

圖4 Annexin V/FITC 染色檢測PCT 對H2O2 損傷VSMCs 凋亡的影響 A:對照組；B:400 μM H2O2 處理組；C:40 μM PCT＋400 μM H2O2 處理組；D:各組VSMCs 凋亡率， 注: 與對照組相比，＃＃P ＜0.01，與H2O2 組相比，**P＜0.01

圖5 PCT 對H2O2 損傷VSMCs 形態和細胞核的影響 A: 倒置顯微鏡觀察各組VSMCs 形態變化；B: Hoechst 33258 檢測各組VSMCs 凋亡情況。 從左到右依次為:對照組， 400 μM H2O2 處理組，40 μM PCT＋400 μM H2O2 處理組

討 論

在血管內膜損傷的早期，VSMCs 被激活后通過釋放基質金屬蛋白酶導致細胞外基質、膠原或彈力纖維的解離，促使VSMCs 增殖與遷移，同時，VSMCs的大量增殖也會使得新生內膜的增厚及血管腔的狹窄，VSMCs 可通過穩固纖維帽而使AS 斑塊穩定[1]，但隨著病變發展到晚期階段，VSMCs 作為AS 發展中的關鍵炎癥細胞，其不正常凋亡及壞死將會導致斑塊不穩定以及血栓的形成[9-10]。 有研究表明，氧化應激反應在AS 的病程發展中至關重要，H2O2作為血管細胞中最重要的活性氧，能夠被過氧化物酶催化產生氧次氯酸[11]。 因此，本研究建立了由H2O2誘導的氧化應激VSMCs 模型，探討了PCT 在AS 中的作用，研究結果表明，VSMCs 經不同時間和不同濃度的H2O2處理后，其活性明顯下降，導致VSMCs 的死亡數目增加。

圖6 PCT 對H2O2 誘導VSMCs 中相關凋亡蛋白表達的影響 A: Western blot檢測各處理下VSMCs 凋亡相關蛋白表達水平；B ～D: 各處理下VSMCs 中Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白相對表達量， 注:與對照組相比，＃＃P ＜0.01；與H2O2組相比，* P＜0.05，**P＜0.01

圖7 PCT 對H2O2 處理的VSMCs 中PI3K、Akt、eNOS 磷酸化水平的影響 A:Western blot 檢測各組VSMCs PI3K-Akt-eNOS 信號通路相關蛋白的表達；B ～D 依次為:各處理VSMCs 中p-PI3K、p-Akt、p-eNOS 蛋白相對表達量 注:與對照組相比，＃＃P ＜0.01；與H2O2組相比，* P＜0.05，**P＜0.01

通過本研究表明，PCT 可以對H2O2誘導的VSMCs 損傷起到保護作用，PCT 預處理VSMCs 可呈濃度依賴地抑制H2O2誘導的VSMCs 活力降低與凋亡率增加。 LDH 的釋放與細胞膜完整性相關，一旦細胞膜受損，LDH 會釋放到細胞外，因此通過檢測細胞培養上清液中LDH 的水平即可判斷細胞的受損程度[12]。 SOD 可清除細胞內自由基，對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞，復原因自由基造成的對細胞傷害[13]。 為了進一步確定用PCT 預處理是否可以減輕H2O2誘導的損傷，我們檢測了VSMCs 中LDH 與SOD 活力，結果顯示PCT 預處理可使細胞內LDH 活力下降而SOD 活力升高，證明PCT 可以增強VSMCs 抗氧化能力。

Bcl-2 和Caspase 蛋白家族在細胞凋亡過程中發揮著重要作用。 Bcl-2 家族蛋白可通過影響線粒體膜的通透性來調控細胞凋亡，其中Bcl-2 具有抑制凋亡的功能，而Bax 可以與Bcl-2 結合形成異二聚體，從而促進細胞凋亡[14]。 本研究結果表明，H2O2誘導下VSMCs 中Bax 和caspase-3 的蛋白表達水平明顯增加，Bcl-2 蛋白表達水平明顯減少，而PCT 預處理VSMCs 后，Bax 和caspase-3 蛋白表達隨PCT 濃度增加而逐漸下降，Bcl-2 蛋白表達逐漸增加。

PI3K/Akt 信號通路被認為是調控細胞生長、存活和轉移的關鍵通路[15]，可起到抑制中性粒細胞的活化與聚集，減輕細胞的凋亡以及保護線粒體等作用。 eNOS 是PI3K/Akt 通路下游的重要底物之一，Akt 可以直接激活eNOS 釋放NO，從而起到保護冠狀動脈、抑制血小板粘附及減輕炎癥反應等作用[16]。 已有研究表明，激活PI3K/Akt 通路可促進VSMCs 增殖、凋亡與遷移[17]。 本研究結果顯示，H2O2誘導下VSMCs 中p-PI3K、p-Akt 和p-eNOS 蛋白表達水平下降，而PCT 預處理后p-PI3K、p-Akt 和p-eNOS 的蛋白表達水平呈濃度依賴性地升高，推測PCT 抗VSMCs 凋亡作用可能由PI3K/Akt/eNOS 信號通路所介導。

綜上所述，PCT 對H2O2損傷的VSMCs 具有一定的保護作用，可以減輕H2O2誘導的VSMCs 細胞凋亡，可能是通過激活PI3K-Akt-eNOS 信號傳導途徑實現的。 本研究為動脈粥樣硬化提供了新的治療靶點及治療手段，并為進一步闡明動脈粥樣硬化以及其他血管增生性疾病的機理提供了新的視角。 然而，目前對PCT 的研究還是普遍集中在生物活性上，臨床藥理學方面的研究和應用仍相對較少，同時，PCT 對人體治療的有效性也尚未確立，仍需通過大量的基礎研究及臨床試驗來進一步探討其在心血管疾病的具體作用。