添加芽孢桿菌對豆粕固體發酵的影響

陳倩倩 劉 波 王階平 劉國紅 鄭雪芳 李慧敏

(福建省農業科學院農業生物資源研究所1，福州 350002)(福州大學生物科學與工程學院2，福州 350002)

豆粕是大豆提取油脂后的副產品，含其中的粗蛋白含量高達40%～50%，氨基酸豐富，尤其富含其他植物性飼料易缺的的賴氨酸，是理想的植物性蛋白飼料[1,2]。然而，豆粕中含有胰蛋白酶抑制劑等多種抗營養因子，如植酸、胰蛋白酶抑制劑等，阻礙了腸道內蛋白酶的活性，降低消化率，不利于動物消化道吸收，甚至導致動物腸道失衡，造成畜禽養殖損失[3]。微生物在發酵過程中產生多種酶類，如蛋白酶、纖維素酶和植酸酶等，鈍化抗營養因子，并可將蛋白質分解為小肽，改善產品品質以及適口性，促進飼料消化吸收，提高飼料轉化率[4-6]。

豆粕接種優良微生物菌種進行固態發酵，微生物在發酵過程中分泌度多種酶類對豆粕中的有機物進行分解和利用，同時產生多種維生素和活性物質，提升豆粕營養價值。生產過程能耗低、無廢水、成本低、產能高，易于操作[7-9]。用發酵后的豆粕飼喂仔豬等幼畜，可以降低仔豬料重比，改善腹瀉癥狀，提高其生產性能[10-12]。常用發酵微生物包括芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌和曲霉等[13,14]。芽孢桿菌是能夠產生芽胞，抗逆性強，耐受高溫、高壓和強酸堿，可以耐受胃酸和上消化道膽鹽和消化液的破壞，抵達下消化道并定植生長。芽孢桿菌生長消耗氧氣，維持腸道厭氧環境，促進乳酸菌等厭氧益生菌的生長，抑制好氧病原菌，維持腸道微生態平衡[15]。同時，芽孢桿菌還能夠分泌纖維素酶和淀粉酶等胞外酶，添加至飼料中可以改善動物自身消化酶的分泌不足，促進動物營養代謝[16]。王格等[17]采用高通量測序技術分析了芽孢桿菌混合發酵豆粕過程細菌群落結構及演替規律，芽孢桿菌屬相對豐度隨著發酵進行而降低，乳酸菌先升高后趨于穩定；芽孢桿菌混合發酵抑制有害菌如大腸桿菌和沙門氏菌的生長。

枯草芽孢桿菌是理性的微生物功能飼料添加劑，廣泛應用于飼料生產，提升豆粕發酵水平和營養價值[15,16]。然而，枯草芽孢桿菌對發酵豆粕細菌群落的影響還需要進一步研究。基于此，本研究以豆粕作為主要發酵材料，添加枯草芽孢桿菌JK2進行固體發酵，分析發酵過程的理化性質及營養成分；并采用IlluminaMiseq對其中的細菌群落測序分析，研究添加芽孢桿菌對豆粕細菌群落的影響，為豆粕的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗菌株：枯草芽胞桿菌FJAT-FB1(BacillussubtilusFJAT-FB1)，本實驗室分離保藏菌株。

LB培養基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH值至7.0～7.2。豆粕、麩皮(市售)。

1.2 方法

1.2.1 發酵豆粕：以豆粕為主要發酵原料，加入5%麩皮，調整含水量至50%。

選取芽孢桿菌單菌落至LB培養基中，35 ℃搖床180 r/min培養12 h。4 ℃下2 000 r/min離心5 min，用超純水重懸，調整至OD600為1.0。芽孢桿菌發酵組，添加5%的上述芽孢桿菌菌液；對照組添加等量清水。將各組置于35 ℃溫箱中靜置發酵7 d。每天進行發酵樣品中心溫度和pH的檢測。B0(添加芽孢桿菌的豆粕)和W0(清水對照初始豆粕)經過7 d的發酵，均呈現較好的發酵氣味和色澤。發酵后的豆粕顏色稍深，尤其是對照組W7樣本顏色最深，呈黃褐色；添加芽孢桿菌發酵的B7有獨特芳香氣味。

1.2.2 發酵飼料理化性質分析

取發酵前后的豆粕10 g，加入90 mL純水，渦旋混勻，5 000 r/min離心10 min，獲得發酵上清液。上清液進行梯度稀釋后，采用水質儀檢測N和C指標。

采用GC-MC檢測發酵飼料中的棕櫚酸和亞油酸：稱取2 g豆粕樣品加入4 mL丙酮，于漩渦震蕩器振蕩混勻后，超聲30 min，放于4 ℃萃取3 h，取上清液1.8 mL，離心(10 000 r/min，4 ℃)10 min，倒出上清液，棄沉淀。取上清液，過0.22 μm過濾器于GC小瓶內，進行GC-MS檢測，分析豆粕經發酵前后物質組成。

1.2.3 發酵豆粕總DNA的提取及微生物組測序

每個樣本稱取500 mg發酵豆粕，分別進行總DNA的提取。采用細菌引物338F 和 806R擴增細菌16S rDNA基因，PCR反應重復3次，取相同體積混合后進行目的片段回收。所用膠回收試劑盒為AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒。采用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統對回收PCR產物進行定量檢測。然后構建插入片段為350 bp的paired-end(PE)文庫，經過Qubit定量和文庫檢測，HiSeq上機測序。

1.2.4 微生物組測序數據質控與分析

對測序得到的原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據。采用Mothur軟件(version 1.36.1)基于上述有效數據進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析。從各個OTU中挑選出一條序列作為該OTU的代表序列，將該代表序列與已知物種數據庫進行物種注釋分析；根據每個OTU中序列的條數，得到各個OTU的豐度值。采用QIIME軟件的迭代算法，進行主成分分析(PCA)。物種熱圖利用顏色梯度可以很好反應出樣本在不同物種下的豐度大小以及物種聚類、樣本聚類信息，可利用R語言的gplots包的heatmap.2函數實現。

2 結果與分析

2.1 發酵飼料理化性質分析

對發酵溫度的檢測顯示，發酵1 d后溫度即有明顯升高。加入芽孢桿菌發酵在第1 d溫度即達到峰值(47 ℃)，對照組發酵2 d后，溫度達到峰值(42 ℃)，添加芽孢桿菌發酵促進豆粕升溫。此后溫度下降，至第5 d，溫度略有回升。豆粕發酵后的pH從初始的6.45降至4.43，對照組的pH在發酵第3 d最低(5.7)，而后升高。在降到pH值最低后，各實驗組pH值均有升高的趨勢，但有部分組后期又降低。這可能是由于剛發酵時，會產生一些有機酸、乳酸等酸性代謝產物，使得發酵豆粕pH值降低，但發酵一定時間后芽孢桿菌在發酵過程中產生蛋白酶，蛋白酶降解豆粕中蛋白質產生胺類物質，甚至產生一些氨氣使得產物pH升高。發酵飼料的pH大多在3.6～4.5之間，抑制腸道中致病菌的生長和繁殖。添加芽孢桿菌發酵，促進豆粕中微生物產酸，降低豆粕pH。

發酵起始，C/N、亞油酸和棕櫚酸含量基本一致。發酵后，豆粕中的C/N呈現上升趨勢，對照組起始值為0.34，發酵7 d后為1.75；芽孢桿菌組起始值為0.33，發酵后為1.97。亞油酸含量隨著發酵而降低，芽孢桿菌組B7的亞油酸含量低于W7；芽孢桿菌組發酵后棕櫚酸含升高量，對照中棕櫚酸含量降低，芽孢桿菌組B7的棕櫚酸含量高于W7。豆粕中的亞油酸含量高于棕櫚酸。

圖1 豆粕固體發酵溫度變化

圖2 豆粕固體發酵pH變化

圖3 發酵飼料營養成分比較

2.2 不同發酵飼料細菌多樣性評估

細菌豐富度和多樣細菌最高值為最大值為B7和W7，發酵后豆粕中的細菌種類和數量都有所增加。反映群落豐富度的chao和sobs指數，范圍分別為119(B0)-148(W7)和99(W0)-121(W7)，數值越大，群落豐富度越高，W7豆粕細菌含量最高；香農指數和辛普森指數反映群落多樣性，香農指數越高多樣性越豐富，而辛普森指數恰好相反，它們范圍分別在2.21(B0)～2.70(W7)和0.102(B7)～0.146(W0)，發酵后的豆粕中(B7和W7)細菌更具多樣性。測序覆蓋率均在99.9%以上，已經基本覆蓋樣本中的所有物種。

表1 測序數據多樣性指數

2.3 發酵飼料中細菌群落結構分析

4種發酵豆粕中共檢測到230種OTU類型，包含11個門，17綱，34目，63科，113屬細菌。發酵豆粕中的主要細菌為厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)和放線菌門(Actinobacteria)(圖4)。B0的厚壁菌門的相對質量分數為97.8%，放線菌門為2.3%；發酵后的B7中，變形菌門相對質量分數為10.7%，厚壁菌門質量分數為88.9%。對照樣本中，W0的厚壁菌門細菌占比98.3%；發酵后的W7中，厚壁菌門相對質量分數為93.3%，變形菌門相對質量分數為3.9%，放線菌門質量分數為2.7%。在發酵初期豆粕中厚壁菌門相對質量分數高于發酵后的豆粕；發酵后的豆粕中變形菌門和放線菌門細菌相對質量分數增加。

圖4 發酵飼料細菌門組成

發酵前的豆粕中，主要細菌為未分類的魏斯氏菌(unclassifiedWeissella)、耐久腸球菌(Enterococcusdurans)和類腸膜魏斯氏菌(Weissellaparamesenteroides)(圖5)。其中，未分類的魏斯氏菌的含量最高，在W0和CK0中的質量分數分別為19.4%和23.5%。這3種細菌經過發酵相對質量分數均降低，其中對照組中的未分類的魏斯氏菌由19.4%降至1.7%，耐久腸球菌和類腸膜魏斯氏菌分別降至5.7%和2.3%。在芽孢桿菌組中，未分類的魏斯氏菌和耐久腸球菌和類腸膜魏斯氏菌分別降至14.3%和1.8%；類腸膜魏斯氏菌相對含量略有升高。魏斯氏菌是參與食品發酵的重要微生物，發酵過程產生乳酸、短鏈脂肪酸和低聚糖等，增加食品風味[18,19]。發酵后的豆粕中，乳桿菌屬的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、橋乳桿菌(L.pontis)和發酵乳桿菌(L.fermentum)的相對含量升高，成為發酵豆粕的優勢菌。W7中的主要乳酸菌為嗜酸乳桿菌(L.acidipiscis)，B7主要為發酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌。芽孢桿菌消耗易吸收的營養成分，不利于生長緩慢的嗜酸乳桿菌增殖[20]，可能是導致其中嗜酸乳桿菌含量降低的重要原因。B7的乳酸菌種類更為豐富，發酵乳桿菌分布較廣，是傳統發酵食品中的優勢微生物，能夠在寡營養條件下增殖[21]；橋乳桿菌是豆清發酵液中的主要微生物[22]；鼠李糖乳桿菌耐酸性強[23]。這些乳桿菌發酵產生大量乳酸，增加飼料適口性，同時降低飼料pH，抑制病原微生物生長，提高食品的質量和營養，廣泛應用于食品發酵、水產養殖和畜牧生產等方面[24,25]。

圖5 發酵飼料細菌種組成

2.4 發酵飼料中細菌差異分析

在種水平，芽孢桿菌組的發酵乳桿菌、橋乳桿菌、未分類魏斯氏菌、巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)及類腸膜魏斯氏菌含量明顯高于對照(圖6)。乳桿菌和醋酸菌廣泛分布于發酵食品，是一類重要的工業微生物，通常存在于傳統發酵食品如酸奶、食醋、開菲爾和紅茶菌中，促進功能性化合物的生成，提升產品風味和質量[26,27]。乳酸片球菌是一種乳酸菌，發酵過程產生乳酸，廣泛應用于發酵飼料，其代謝產物能夠調節胃腸道菌群，提高動物免疫力[28,29]。嗜酸乳桿菌、未分類葡萄球菌(unclassifiedStaphylococcus)、耐久腸球菌、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)及未分類微小桿菌(unclassifiedExiguobacterium)在對照組含量高于芽孢桿菌組。嗜酸乳桿菌培養物能夠抑制腸道病原菌生長，促進腸絨毛發育，改善腸道形態結構，促進斷奶仔豬生長[11]。耐久腸球菌多存在于動物腸道中，作為腸道微生物產生蛋白酶、纖維素酶等，參與營養成分的水解和吸收[30,31]。但是其中葡萄球菌屬和明串珠菌屬的某些細菌為條件致病菌，存在于飼料中，對動物安全產生隱患，對養殖業造成巨大經濟損失。添加芽孢桿菌發酵則能夠降低此類條件致病菌的含量，這與王格等[17]的研究結果一致。

圖6 飼料細菌種水平分布差異分析

2.5 理化因子相關性分析

環境因子相關性分析結果可以看出：C/N和棕櫚酸對豆粕發酵細菌的影響一致(圖7)。棕櫚酸的含量與葡萄球菌屬含量呈現顯著性負相關，棕櫚酸含量越高，該屬細菌含量越低；此外，醋酸菌屬與棕櫚酸呈現正相關，高含量的棕櫚酸促進醋酸菌的生長。棕櫚酸是一種長鏈脂肪酸，作為化感物質，能夠調節環境菌群，前人研究發現棕櫚酸能夠抑制病原真菌，保持土壤中的微生物多樣性[32]。本研究發現棕櫚酸含量升高，有助于提高飼料中醋酸菌屬細菌的數量，抑制葡萄球菌屬細菌的數量，棕櫚酸對發酵飼料微生物群落的影響以待進一步研究。高C/N的環境同樣促進醋酸菌的生長，同時抑制腸桿菌屬、葡萄球菌屬和鏈球菌屬細菌的生長。因此，在豆粕發酵中，調節合適的C/N能夠抑制疑似病原菌的生長，保持飼料健康發酵。pH與亞油酸對細菌有相似的影響。pH的升高與腸桿菌屬和葡萄球菌屬呈正相關，尤其是葡萄球菌屬的含量與之顯著性相關；乳桿菌屬和醋酸菌屬與pH的升高呈現負相關，含量隨pH的降低而升高，醋酸菌屬的相關性更為顯著。乳桿菌屬和醋酸菌生長過程產生乳酸和醋酸等有機酸，降低豆粕pH，賦予其良好的口感[33]；同時，產生的有機酸抑制病原菌的生長。氣球菌屬(Aerococcus)與亞油酸含量顯著相關，樣本中亞油酸含量越高，該細菌含量越高。亞油酸是一種重要的天然活性脂肪酸，具有抗氧化，降低膽固醇，提高機體免疫力的功能，同時作為飼料添加劑應用與養殖業，提高畜禽品質[34, 35]。高含量的亞油酸促進疑似病原菌氣球菌屬細菌的含量，因此，使用亞油酸作為飼料添加劑應控制劑量。

圖7 環境因子與發酵飼料細菌群落相關性分析

3 結論

添加芽孢桿菌FJAT-FB1促進豆粕發酵升溫，降低pH，提高C/N和棕櫚酸含量。4種發酵豆粕中共檢測到230種OTU類型，包含11個門，17綱，34目，63科，113屬細菌。發酵后豆粕中的細菌多樣性和豐富度增加。發酵豆粕中的主要細菌為厚壁菌門、變形菌門和放線菌門，厚壁菌門的魏斯氏菌屬和乳桿菌屬是優勢菌。添加芽孢桿菌發酵提高乳酸菌含量，降低條件致病菌的含量。相關性分析顯示乳桿菌屬和醋酸菌屬與pH降低密切相關；化感物質棕櫚酸與醋酸菌屬細菌呈正相關，與葡萄球菌屬細菌呈負相關。