超臨界CO2萃取粉末磷脂的研究

高佳佳 王偉寧 郝凱越 朱秀清 王立琦 于殿宇 潘明喆 羅淑年

(東北農業大學食品學院1，哈爾濱 150030)(哈爾濱商業大學2，哈爾濱 150028)(九三集團惠康食品有限公司3，哈爾濱 150069)

超臨界CO2萃取技術具有無化學溶劑消耗和殘留、對環境無污染、萃取效率高、易回收、工藝簡單、操作溫度較低可有效保護熱敏的活性物質、得到的產物的品質和純度高等優點，已被廣泛應用于油脂等功能性成分的制備[1-4]。

黑龍江省是國家最大的非轉基因大豆生產區[5-7]，由于環境及運輸問題，植物油料中會含有多環芳烴(Polycyclic aromatic hydrocabons，PAHs)[8-9]，這些親脂性的PAHs在大豆加工過程作會進入到油相[10]，大豆磷脂作為一種天然表面活性劑[11]，具有較強的吸附作用，在油脂精煉過程中PAHs會逐漸富集在磷脂表面，食品添加劑聯合專家委員會(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, JECFA)認為人類主要通過谷類制品和植物油脂攝入PAHs[12]，具有慢性毒性和致癌、致畸、致突變的“三致”作用[13-15]。

大豆油腳是大豆油精煉時的重要副產物，大豆毛油經過脫膠得到油腳，油腳經真空脫水后得到大豆濃縮磷脂[16-19]，大豆濃縮磷脂是一類淺棕色或淡黃色半透明稠狀物質，具有一定的功能特性，略微帶有豆腥味，容易氧化變性[20-25]。

大豆粉末磷脂是從大豆濃縮磷脂中進一步提純得到的，其具有降血脂、抗脂肪肝、防衰老、兒童健腦益智等作用，已作為多種保健品組方的關鍵成分，也是大豆磷脂深加工起始原料[26]。目前工業化生產常用溶劑萃取法制備大豆粉末磷脂，利用磷脂不溶于丙酮，而油脂及其它脂溶性物質均易溶于丙酮特性，將大豆濃縮磷脂經脫油除雜，再經干燥后制取粉末磷脂[27]，溶劑萃取法溶劑用量和損耗過大，存在毒性會對環境造成污染[28]，溶劑萃取法得到的大豆粉末磷脂含有一定量的雜質及PAHs，同時溶劑殘留限制了大豆粉末磷脂在高檔食品以及乳品行業中的應用，以及轉基因問題限制了其在藥品行業的應用。此外，普通大豆粉末磷脂的HLB值約為6～7[29]，而本文采用的超臨界CO2萃取法選擇不添加夾帶劑，二氧化碳可以充分發揮溶解和擴散能力強的優點，與原料顆粒充分接觸，有效地將顆粒中所含的油類物質帶走[30]，由此得到的大豆粉末磷脂的HLB值很可能會提高，從而進一步增強大豆粉末磷脂的親水性，使其應用范圍更加廣泛。

因此，本研究以非轉基因大豆濃縮磷脂為原料，選擇正己烷作為溶劑，通過添加不同特性的吸附劑，以期脫除PAHs及雜質。并在超臨界CO2狀態下，研究萃取的壓力，溫度，時間，對大豆粉末磷脂萃取效率的影響，以期生產高品質的非轉基因大豆粉末磷脂，拓寬非轉基因大豆產品市場。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

大豆濃縮磷脂：外購，經檢測PAH16的含量為38.2 μg/kg，酸價為18.53 mg/g，其他組分為：不溶性雜質0.3%、丙酮不溶物60.17%、水分及揮發物1.0%。

正己烷、3，5-二硝基水楊酸、乙醚(分析純)和丙酮。

白土；凹凸棒；硅藻土+助濾劑；進口活性碳8018-8；進口活性碳8017-6。

1.1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀；RE-52A型旋轉蒸發器；LD4-2A型低速臺式離心機；Ha121-50-013L×2超臨界CO2萃取設備；恒溫水浴鍋；SHB-Ⅲ-循環水式多用真空泵；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器；HG-9075A型電熱恒溫鼓風干燥箱；722型可見分光光度計；G4號砂芯漏斗等。

1.2 試驗方法

1.2.1 濃縮磷脂中不溶性雜質及多環芳烴的去除

稱取大豆濃縮磷脂100 g于1 000 mL三角瓶中，向其中添加不同量的正己烷，渦旋震蕩使大豆濃縮磷脂充分溶解，添加一定量的吸附劑于三角瓶中，搖晃，充分混勻，放入轉子。水浴升溫至指定溫度，調整攪拌速度，冷凝回流2 h，靜置1.5 h后，在3 000r/min的轉速下離心10 min，收集大豆濃縮磷脂進行旋轉蒸發，脫除溶劑，得到精制大豆濃縮磷脂。

1.2.2 粉末磷脂萃取試驗1.2.2.1 單因素試驗

將精制大豆濃縮磷脂加入料筒并放入萃取罐中，裝好壓環和密封圈，旋緊上堵頭，在操作面板的控溫儀上設定萃取溫度分別為40～65 ℃，進行加熱，設定CO2流量為28 L/h，調節壓力控制閥門，待萃取壓力分別為20～45 MP時，開始循環萃取，并保持恒壓恒溫，分別循環萃取30～180 min后，從萃取罐取出料筒，將磷脂取出進行稱量，計算粉末磷脂萃取率。

1.2.2.2 響應面優化試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Benhnken中心組合設計，以萃取壓力(A)、萃取溫度(B)、萃取時間(C)為自變量，以萃取率(R)為響應值設計三因素三水平響應面試驗，表1為響應面因素與水平表。

表1 響應面因素與水平表

1.2.3 不溶性雜質含量測定

參照GB/T 1 5688—2008《動植物油脂 不溶性雜質含量的測定》進行檢測。

1.2.4 不溶性雜質含量的計算

(1)

式中：w0為樣品的質量/g；w1為干過是過濾器的質量/g；w2為坩堝式過濾器及干殘留物的質量/g。

1.2.5 多環芳烴含量測定與計算

參照GB 5 009.265—2016《食品安全國家標準 食品中多環芳烴的測定》進行檢測。

1.2.6 多環芳烴脫除率的計算

(2)

式中：w3為脫除前大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量/μg/kg；w4為脫除后大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量/μg/kg。

1.2.7 粉末磷脂萃取率的計算

(3)

式中：w5為精制大豆濃縮磷脂含量/g；w6為大豆粉末磷脂含量/g。

1.2.9 HLB值的測定

用Span80和Tween80調合成標準測定所需HLB值的油作為標準油，按標準油的質量分數配成不同需要的HLB值標準混合油，HLB值分別為9、10、11、12、13、14六個標準油。然后按m(大豆粉末磷脂)∶m(油)∶m(雙蒸水)=1∶3∶16配制，在搖床上以200r/min搖動5 min，取出分別加到標號后的50 mL帶刻度量筒中，靜置12 h記錄分離出來的水量，最小析水量對應的標準油HLB值即為測定樣品HLB值。

1.3 工業化生產

利用試驗所得參數在工業化生產線上將大豆濃縮磷脂加工成超臨界CO2萃取大豆粉末磷脂，并計算相應得率。

1.4 數據統計分析方法

所有指標的測定都重復3次，試驗結果以平均值和標準誤差值表示，數據采用Origin7.5進行分析和繪制。

2 結果與討論

2.1 濃縮磷脂中不溶性雜質的去除

正己烷添加量對不溶性雜質含量的影響效果見表2

表2 正己烷添加量對不溶性雜質含量的影響

表2可見，隨著正己烷添加量的增加，由于雜質不溶于正己烷，因此過濾后的磷脂中的雜質含量逐漸下降，當添加量大于1.5 mL/g后，雜質的含量下降不明顯，確定正己烷最適1.5 mL/g。

2.2 濃縮磷脂中多環芳烴脫除的效果

2.2.1 不同吸附劑對多環芳烴脫除效果的影響

分別添加5%的白土、凹凸棒、硅藻土+助濾劑、進口活性碳8018-8、進口活性碳8017-6五種吸附劑，在正己烷添加量為1.5 mL/g，溫度50 ℃，時間3 h、攪拌速度1 500 r/min的條件下進行多環芳烴的脫除試驗，研究不同吸附劑對大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量及脫除率的影響，結果如表3所示。

表3 吸附劑種類對多環芳烴脫除效果的影響

由表3可以看出，在相同脫除條件下，活性炭的脫除效果明顯優于活性白土，這與Yebra-Pimentel等[31]研究結果基本一致。此外，本試驗的結果表明凹凸棒及兩種進口活性炭脫除大豆濃縮磷脂中多環芳烴的效果均較好，脫除后，大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量分別為2.3、2.0、2.2 μg/kg，脫除率均在94%以上且相差不大，但兩種進口活性炭價格相對較高，綜合考慮，選擇凹凸棒作為脫除大豆濃縮磷脂中多環芳烴的吸附劑為宜。

2.2.2 吸附劑用量對多環芳烴脫除效果的影響

分別添加2%、3%、4%、5%、6%的凹凸棒，在正己烷添加量為1.5 mL/g，溫度50 ℃，時間3 h，攪拌速度1 500 r/min的條件下時進行多環芳烴的脫除試驗，研究不同吸附劑添加量對大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量及脫除率的影響，結果如圖1所示。

圖1 吸附劑用量對多環芳烴含量及脫除率的影響

由圖1可以看出，大豆濃縮磷脂中PAH16含量隨凹凸棒添加量的增加而降低，而脫除率隨凹凸棒添加量的增加明顯增加，當添加量增加至5%以后PAH16及脫除率均沒有明顯變化，為節約成本，綜合考慮，選擇凹凸棒的添加量為5%。

2.2.3 時間對多環芳烴脫除效果的影響

在正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，溫度50 ℃，攪拌速度1 500 r/min時分別選取時間1.5、2、2.5、3、3.5 h的條件下時進行多環芳烴的脫除試驗，研究時間對大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量及脫除率的影響，結果如圖2所示。

圖2 時間對多環芳烴含量及脫除率的影響

由圖2可以看出，大豆濃縮磷脂中PAH16含量隨時間的延長而降低，當達到3 h后降低緩慢，3 h以后PAH16含量及脫除率均隨時間的延長沒有顯著降低，在保證大豆濃縮磷脂產品質量的基礎上，綜合考慮試驗及未來生產成本，選擇脫除時間為3 h。

2.2.4 溫度對多環芳烴脫除效果的影響

在正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，時間3 h，攪拌速度1 500 r/min時分別選取溫度35、40、45、50、55 ℃的條件下時進行多環芳烴的脫除試驗，研究溫度對大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量及脫除率的影響，結果如圖3所示。

圖3 溫度對多環芳烴含量及脫除率的影響

由圖3可以看出，大豆濃縮磷脂中PAH16含量隨溫度的增加而降低，脫除率隨溫度的增加而增加，當溫度升高至50 ℃以后，PAH16含量及脫除率均沒有顯著變化，因此，選擇溫度為50 ℃。

2.2.5 攪拌速度對多環芳烴脫除效果的影響

在正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，溫度50 ℃，時間3 h時分別選取攪拌速度900、1 200、1 500、1 800、2 100 r/min的條件下時進行多環芳烴的脫除試驗，研究攪拌速度對大豆濃縮磷脂中多環芳烴含量及脫除率的影響，結果如圖4所示。

圖4 攪拌速度對多環芳烴含量及脫除率的影響

由圖4可以看出，攪拌速度越大，大豆濃縮磷脂中多環芳烴的含量越低，脫除率越高，當攪拌速度為1 500 r/min以后，PAH16含量及脫除率均沒有顯著變化，因此，選擇脫除試驗的攪拌速度為1 500r/min。

2.2.6 脫除多環芳烴及雜質的最佳條件

當凹凸棒添加量為5%，正己烷添加量為1.5 mL/g，溫度50 ℃，時間3 h，攪拌速度1 500 r/min的時進行試驗，可得到不溶性雜質含量為0.05%，多環芳烴含量為2.29 μg/kg的精制大豆濃縮磷脂。

2.3 超臨界CO2萃取粉末磷脂的效果

萃取壓力主要會影響超臨界流體的密度，從而對萃取率產生影響[32]。設置這一過程的壓力范圍為20～45 MPa(CO2流速28 L/h、萃取溫度50 ℃、萃取時間120 min)，對精制大豆濃縮磷脂進行超臨界萃取。超臨界CO2的性質受到萃取溫度的影響，試驗中選擇從溫度40 ℃開始，最高溫度達到65 ℃(CO2流速28 L/h、萃取壓力35 MPa、萃取時間120 min)，測定萃取溫度對粉末磷脂的萃取率的影響。超臨界CO2的性質受到萃取時間的影響，試驗中選擇從時間30 min開始，最長時間為180 min(CO2流速28 L/h、萃取壓力35 MPa，萃取溫度為50 ℃)，測定萃取溫度對粉末磷脂萃取率的影響。

從圖5中可以看出，隨著萃取壓力的增加，萃取率成增大趨勢。當萃取壓力達到35 MPa時，萃取率為81.34%。但隨著壓力增加，當壓力過高時，溶質的擴散系數減小，傳質阻力增大，萃取能力反而下降[33]。超過35 MPa后，萃取效率又出現下降趨勢，因此，可選擇壓力為35 MPa進行萃取。隨溫度升高，大豆粉末磷脂的萃取率逐漸增加，溫度50 ℃時萃取率最高，達到83.37%。當溫度進一步升高，萃取率逐漸降低，這可能是因為溫度過高降低了超臨界流體的密度，使物質的溶解度降低而不利于萃取[34]。因此，選擇50 ℃為宜。萃取時間越長，磷脂萃取率越高，但達到一定程度后，隨著萃取時間的延長，磷脂萃取率增加放緩。萃取時間增加，有利于超臨界流體與粉末磷脂成分的溶解平衡，這樣增加萃取時間就會增加萃取收率，但萃取時間過長，動力消耗增加，生產成本也會增加。兼顧經濟效益，確定最佳萃取時間為120 min。

圖5 不同條件對粉末磷脂萃取率的影響

2.4 響應面優化

2.4.1 設計與結果

通過Design-Expert8.0.6軟件設計設定A(萃取壓力)、B(萃取溫度)、C(萃取時間)分別是影響因素，R(萃取率)為響應值得到3因素3水平設計與結果，如表4所示。

表4 響應面試驗設計與結果

2.4.2 模型方差與分析

利用Design Expert8.0.6軟件對2.4.1中試驗結果進行方差分析，得到回歸線方程為：

R=+82.76+2.49A-2.06B+3.55C+1.08AB+1.15AC-0.65BC-4.39A2-4.29B2-5.27C2，回歸模型的方差分析表如表5所示。

表5 回歸模型的方差分析

根據響應面結果可知，A(萃取壓力)C(萃取時間)之間交互作用極顯著，A(萃取壓力)B(萃取溫度)之間交互作用較為顯著，B(萃取溫度)C(萃取時間)交互作用對萃取率的影響相對較小。

2.4.3 超臨界CO2萃取粉末磷脂的最佳條件

通過響應面圖及結果分析可以得出，超臨界CO2萃取粉末磷脂的最佳條件為：萃取溫度48.84 ℃，萃取壓力36.52 MP，萃取時間131.54 min。萃取率可達84.06%。考慮到試驗條件及操作實際性和便利性，將最佳條件調整為萃取溫度50 ℃，萃取壓力35 MP，萃取時間130 min。根據調整后的參數進行3次重復平行試驗，得到萃取率可達83.76%，與理論預測值的偏差較小。說明利用此響應面對超臨界CO2萃取粉末磷脂的最佳條件的優化結果較為準確，具有較好的可靠性和重現性。

2.5 HLB值的測定

經測定，本實驗生產的大豆粉末磷脂的HLB值為8，高于普通粉末磷脂，故本試驗所得粉末磷脂的親水性比普通粉末磷脂好，應用范圍更廣泛。

2.6 實際工業化生產

將上述試驗數據經優化應用于實際生產，精制大豆濃縮磷脂不溶性雜質含量為0.08%，多環芳烴含量為2.97 μg/kg，經超臨界CO2萃取，得到臨界CO2萃取粉末磷脂，萃取率為83.76%。不溶性雜質含量為0.06%，多環芳烴含量為2.45 μg/kg，HLB值可以達到8。

3 結論

通過添加正己烷除去大豆濃縮磷脂的雜質，并篩選出凹凸棒脫除多環芳烴效果最佳，通過超臨界CO2萃取試驗室研究，取得試驗數據，并通過產業化驗證取得良好效果。通過正己烷添加量為1.5 mL/g，凹凸棒添加量為5%，精制大豆濃縮磷脂含雜質量為0.05%，多環芳烴量為2.29 μg/kg。再經超臨界CO2萃取粉末磷脂含雜質量為0.03%，多環芳烴量為1.83 μg/kg。最后經實際生產，超臨界CO2萃取粉末磷脂質量為雜質量為0.06%，多環芳烴量為2.45 μg/kg，HLB值可以達到8。不僅親水性有所提高，而且多環芳烴含量達到了美國出口的要求，并出口創匯。