兩步水解法制備玉米抗氧化活性肽及產物的穩定性

王曉杰 劉曉蘭 曲 悅 夏春榮 Stanislav Sukhikh Anna Аndreyeva

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江省玉米深加工理論與技術重點實驗室，齊齊哈爾 161006)(康德波羅的海聯邦大學生命系統研究所微生物學和生物技術實驗室，加里寧格勒 236016)

玉米肽是玉米醇溶蛋白經蛋白酶水解或微生物發酵后獲得的低分子量產物。與玉米醇溶蛋白相比，玉米肽的水溶性顯著增加，而且具有多重生物活性，包括抑制血管緊張素轉換酶[1]、促進乙醇代謝[2]、抗氧化[3]、抗炎[4]、抗癌[5]等，在食品工業具有潛在的應用價值。

目前，在玉米抗氧化活性肽制備過程中，優先選擇堿性蛋白酶Alcalase進行酶解[6]，其添加量一般在1%～4%(酶底比)范圍內[7-9]，有的甚至高達到9.13%[10]。由于商用酶制劑價格偏高，大大提高了玉米肽的生產成本，制約了玉米肽的工業化生產和產品推廣。

大麥芽由大麥經浸泡、發芽和熱風干燥(水分4%～5%)制成[11]。在大麥芽中已經發現40多種內切蛋白酶，包括四種常見的蛋白酶類型，分別是天冬氨酸類蛋白酶、半胱氨酸類蛋白酶、絲氨酸類蛋白酶和金屬類蛋白酶[12]。根據蛋白酶對蛋白質的催化部位，大麥芽中的蛋白酶可以分為內肽酶、羧肽酶、氨肽酶、二肽酶等[13]。在啤酒釀造工業，這些蛋白酶可以消化大麥醇溶蛋白以及其他大麥蛋白以增加蛋白質的溶解性；在中醫領域，作為助消化的輔助藥物而廣泛應用。但是，還鮮有將麥芽粉作為蛋白酶制劑應用于玉米肽的制備中。

為解決玉米肽制備過程中商業酶制劑用量偏高的問題，本研究采用麥芽粉和堿性蛋白酶Alcalase對玉米醇溶蛋白進行兩步水解，首先利用麥芽粉中蛋白酶的水解作用將玉米醇溶蛋白的高級結構破壞，將埋藏在分子內部的活性位點暴露出來，為第二步酶解創造有利條件，在保證酶解效率的同時，降低第二步商業酶制劑的使用量；研究玉米抗氧化活性肽的穩定性，為玉米抗氧化活性肽的工業化生產及開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米醇溶蛋白，自制麥芽粉。

堿性蛋白酶Alcalase(6.28 × 105U/mL)；硫代巴比妥酸、菲洛嗪；氧化型谷胱甘肽、還原型谷胱甘肽、2-脫氧-D-核糖、藍色葡聚糖2000、aprotinine、桿菌肽。

1.2 儀器與設備

PC/PLCLD-53真空冷凍干燥機，NDA 701全自動凱氏定氮儀，TDL-5-A離心機，Purifier100蛋白質純化色譜儀，DF-1集熱式磁力加熱攪拌器，Superdex Peptide 10/300 GL凝膠層析柱，pB-10 pH計，TU-1901雙光束紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 麥芽粉的制備

用小型粉碎機在轉速16 000 r/min、時間10 s的條件下反復多次將大麥芽磨成粉末，磨粉過程時刻注意溫度的變化，防止溫度過高使蛋白酶變性。粉碎后過80目篩，得到麥芽粉，在干燥條件下保存。根據GB/T 28715—2012測定麥芽粉的蛋白酶總活力為(268.27±6.11)U/g。

1.3.2 玉米醇溶蛋白兩步酶解法條件的優化

麥芽粉的第一步酶解：取10 g玉米醇溶蛋白放于250 mL燒杯中，加入蒸餾水配制成底物濃度10%的懸浮液，調節pH至5.5。按酶底比30%加入麥芽粉，攪拌均勻，加入大小合適的轉子后，將燒杯放入50 ℃水浴磁力攪拌器中央，開始第一步水解反應。水解過程中通過滴加0.5 mol/L NaOH使pH維持在5.5，水解3 h后獲得第一步酶解液。

堿性蛋白酶Alcalase的第二步酶解：調節第一步酶解液pH至8.5，溫度至60 ℃，加入堿性蛋白酶Alcalase開始酶解反應，酶解過程中通過不斷滴加0.5 mol/L NaOH使pH維持在8.5，在酶解0、0.5、1、1.5、2 h時分別取樣2 mL裝入離心管，放入沸水浴中滅酶5 min。4 000 r/min離心10 min后取上清液用于測定可溶性蛋白含量和抗氧化活性。

通過水解度、可溶性蛋白含量及抗氧化活性三個指標的綜合比較，確定第二步Alcalase酶解的最適酶底比、底物濃度和水解時間。三個因素的實驗范圍為：酶底比：0.5%、0.75%、1.0%；底物濃度：7.5%、10%、12.5%；水解時間：1、2、3、4、5、6、7、8 h。

1.3.3 蛋白質含量的測定

可溶性蛋白含量采用Folin-酚法測定[14]，總蛋白含量采用微量凱氏定氮法測定。

1.3.4 水解度的測定

采用pH-stat法[15]。

1.3.5 抗氧化活性的測定

檢測指標包括羥基自由基清除活性和亞鐵離子螯合能力，測定方法參照文獻[16]。

1.3.6 分子質量分布的測定

將樣品溶解在含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.0的磷酸鹽(PBS，0.02 mol/L)緩沖液中，配置成蛋白質濃度為2 mg/mL的溶液。4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾膜進行過濾。上樣體積100 μL，流速0.25 mL/min，檢測波長214 nm。色譜柱用含有0.15 mol/L NaCl的pH 7.0的PBS(0.02 mol/L)緩沖液進行平衡和洗脫。色譜柱用藍色葡聚糖2000測定外水體積，用標準蛋白(aprotinine，6 500 u；桿菌肽，1 400 u；氧化型谷胱甘肽，612 u；還原型谷胱甘肽，307 u)進行校正。標準蛋白分子量對數lgMr與有效分配系數Kaw的線性回歸方程為y=-3.734 7x+4.815 3，R2=0.982。

1.3.7 玉米抗氧化活性肽穩定性的研究

考察pH、溫度和凍融次數對玉米抗氧化活性肽穩定性的影響。用pH分別為3、5、7、9、11的緩沖液將樣品配制成蛋白質濃度為2 mg/mL的溶液，在25 ℃下保溫60 min后測定羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率，表征pH對玉米抗氧化活性肽穩定性的影響。

將樣品配制成10 mL、2 mg/mL的溶液，分別在4、25、37、100 ℃下放置2 h，通過測定羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率，表征玉米抗氧化活性肽的熱穩定性。

將樣品配制成10 mL、2 mg/mL的溶液，測定-20 ℃冷凍24 h，25 ℃解凍1 h(反復凍融0、1、2、3、4、5次)時玉米肽的羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率，表征玉米抗氧化活性肽的貯藏穩定性。

1.3.8 數據處理

每個實驗平行3次，所有數據均以平均值±標準差表示，用SPSS Statistics 19.0進行統計學分析。采用Duncan檢驗進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著性水平。

2 結果與討論

2.1 玉米醇溶蛋白兩步酶解法的條件優化

2.1.1 最適酶底比的確定

第一步采用麥芽粉水解3 h，不滅酶直接加入堿性蛋白酶Alcalase進行第二步酶解，在反應初始pH 8.5、溫度60 ℃、底物濃度10%、時間2 h的條件下，研究不同酶底比對水解度、可溶性蛋白含量及產物抗氧化活性的影響，結果如圖1所示。在麥芽粉酶解3 h基礎上，加入Alcalase繼續酶解，隨著水解時間的延長和加酶量的增加，水解度和可溶性蛋白含量逐漸增大。這是因為在底物濃度一定的條件下，酶促反應速率和酶濃度成正比，隨著酶添加量增加，水解速率加快，水不溶性的玉米醇溶蛋白在蛋白酶的作用下逐漸被切割成小分子肽段，使可溶性蛋白含量增加。但當酶底比由0.75%增加至1%時，水解度和可溶性蛋白含量之間差異不顯著(P>0.05)，可能是因為當酶底比超過0.75%時，酶相對過量，引起了底物的競爭性抑制[17]，阻礙了酶與底物的結合。

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，余同。

酶底比0.75%制備的玉米肽具有更高的抗氧化活性，可能是因為不同加酶量影響了水解產物中的肽段長度及結構[18]，進而影響了玉米肽的抗氧化活性。在酶底比1%時，玉米醇溶蛋白酶解效率高，隨著水解度的增大，具有抗氧化活性的多肽繼續水解為無抗氧化活性的短肽或游離氨基酸，導致清除羥基自由基和螯合亞鐵離子的能力降低。而酶底比為0.5%時，由于酶解效率低，導致具有抗氧化活性的玉米肽產量較少。兩步水解法是為了利用麥芽粉的初步消解作為而降低Alcalase的使用量，同時制備出高抗氧化活性的玉米肽，因此，確定Alcalase的最適酶底比為0.75%。

2.1.2 最適底物濃度的確定

第一步采用麥芽粉水解3 h，不滅酶直接加入堿性蛋白酶Alcalase進行第二步酶解，在反應初始pH 8.5、溫度60 ℃、酶底比0.75%、時間2 h的條件下，研究不同底物濃度對水解度、可溶性蛋白含量及產物抗氧化活性的影響，結果如圖2所示。在不同底物濃度條件下，玉米醇溶蛋白的水解度之間無顯著性差異(P>0.05)，但對可溶性蛋白含量和抗氧化活性影響較大。在整個水解期間內，當底物濃度由7.5%增加至10%時，可溶性蛋白含量、羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率均增大，但是繼續增加底物濃度，可溶性蛋白含量和抗氧化活性均降低。底物濃度低于10%時，可溶性蛋白含量的提高可歸因于Alcalase對底物的有效消化，從而產生更多具有抗氧化活性的玉米肽。但隨著底物濃度的繼續增加，底物和酶的擴散率均降低[19]，且底物相對過量，Alcalase無法完全消化底物，導致玉米醇溶蛋白消化效率降低，抗氧化活性玉米肽的生成量減少，抗氧化活性降低。因此，選擇最適的底物濃度為10%。

圖2 底物濃度對玉米醇溶蛋白酶解效率及產物抗氧化活性的影響

2.1.3 最適水解時間的確定

第一步采用麥芽粉水解3 h，不滅酶直接加入堿性蛋白酶Alcalase進行第二步酶解，在反應初始pH8.5、溫度60 ℃、酶底比0.75%、底物濃度10%的條件下，研究水解時間對水解度、可溶性蛋白含量及產物抗氧化活性的影響，結果如圖3所示。隨著水解時間的延長，水解度和可溶性蛋白含量均呈逐漸增加的趨勢。第一步酶解時，麥芽粉中蛋白酶的水解作用可以將玉米醇溶蛋白的高級結構破壞，降低底物空間位阻的同時，將埋藏在分子內部的Alcalase的催化位點暴露出來。加入Alcalase進行第二步酶解時，由于加酶量低，所以酶切速度較慢，酶切反應持續進行，水解度持續增加，產生了更多的可溶性蛋白。隨著水解時間的延長，水解產物的羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率均呈先升高后降低的趨勢。玉米肽的抗氧化活性與其肽段長度、構象以及氨基酸組成等因素有關[16]，隨著水解時間延長，Alcalase持續水解，影響了水解產物中肽段的氨基酸組成和構象，進而影響了玉米肽的抗氧化活性。

圖3 水解時間對玉米醇溶蛋白酶解效率及產物抗氧化活性的影響

綜合分析，確定Alcalase的最適水解時間為6 h。在此條件下，水解度、可溶性蛋白含量、羥基自由基清除率及亞鐵離子螯合率分別為24.53%、33.43 mg/mL、30.59%、38.32%。此時的水解度和可溶性蛋白含量與Jin等[7]采用Alcalase(2%)水解玉米蛋白粉75 min的效果相當。

2.2 玉米醇溶蛋白水解產物分子質量分布的測定

食物和動物來源的抗氧化活性肽通常含有2～30個氨基酸殘基，分子質量為500～1 800 u，該范圍內的肽通常具有較高的抗氧化活性，而且容易被人體消化吸收[20,21]。將樣品配制成2 mg/mL的溶液，測定在麥芽粉水解3 h基礎上，堿性蛋白酶Alcalase繼續水解2、4、6 h時水解產物的分子質量分布，洗脫圖譜見圖4～圖6。

圖4 麥芽粉水解3 h+Alcalase水解2 h時樣品的凝膠層析洗脫圖譜

圖5 麥芽粉水解3 h+Alcalase水解6 h時樣品的凝膠層析洗脫圖譜

由圖4可以看出，在麥芽粉水解3 h基礎上，加入Alcalase繼續水解2 h，水解產物的分子質量主要分布在6 500～840 u和840～300 u范圍內。隨著Alcalase水解時間的延長，水解產物的洗脫圖譜逐漸向右移動，分子質量逐漸變小。在Alcalase繼續水解4 h時，分子質量6 500～882 u組分的含量減少了5.18%，而分子質量<300 u組分的含量增加了5.29%，可能是在麥芽粉中存在的羧肽酶和氨肽酶等催化下，導致水解產物中游離氨基酸含量增加；在Alcalase繼續水解6 h時，水解產物的分子量主要分布在300～6 500 u范圍內。從分子質量分布角度看，在麥芽粉的基礎上，Alcalase繼續水解，將玉米醇溶蛋白酶解成低分子量的肽段，也證明兩步酶解效果更顯著。另外，麥芽粉中存在的羧肽酶和氨肽酶，還可以將玉米肽鏈末端的疏水性氨基酸水解掉，進而降低玉米肽的苦味，這還需要進一步的研究證實。

2.3 玉米抗氧化活性肽穩定性的研究

2.3.1 pH對玉米抗氧化活性肽穩定性的影響

將玉米肽溶解在不同pH緩沖液中，研究不同pH對玉米肽羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率的影響，以表征玉米抗氧化活性肽的酸堿穩定性，結果見圖6。與對照相比，pH對玉米肽的羥基自由基清除能力沒有顯著性影響(P>0.05)，而對亞鐵離子螯合能力產生極顯著性影響(P<0.01)。在pH 3～5的條件下，玉米肽不具有亞鐵離子螯合能力；在pH 7時，螯合能力與對照相當；在堿性環境中(pH>9)螯合能力極顯著增加(P<0.01)，尤其是pH 11時，螯合能力達到64.48%。蛋白質和肽的金屬螯合能力可以通過與帶電荷氨基酸殘基之間的靜電相互作用完成[22]。隨著pH值的變化，溶劑介質中的氫離子濃度發生變化，影響了玉米肽的帶電荷性質，進而影響了玉米肽的亞鐵離子螯合能力。因此，將玉米抗氧化肽應用于食品工業時，應該選擇保持其高抗氧化活性的制備條件，可以制備成弱堿性食品。

圖6 不同pH對玉米肽抗氧化活性的影響

2.3.2 溫度對玉米抗氧化活性肽穩定性的影響

在濃度為2 mg/mL，pH為9.0的條件下，研究不同溫度對玉米肽抗氧化活性的影響，以表征玉米肽的熱穩定性，結果如表1所示。與25 ℃相比，4 ℃不能破壞玉米肽的抗氧化活性，而37、100 ℃對玉米肽的抗氧化活性起促進作用，說明玉米肽的抗氧化活性具有一定熱穩定性，這與前人報道相一致[23]?？赡苁且驗橛衩卓寡趸牡目臻g結構簡單，主要具有肽鏈一級結構及少量的二級結構，高溫處理沒有導致肽鏈斷裂，僅使肽鏈部分二級結構展開，暴露一些活性位點于分子表面，從而使玉米肽的抗氧化活性增大。因此，在食品工業中，玉米抗氧化活性肽可以耐受一定時間的高溫處理。

表1 處理溫度對玉米肽抗氧化活性的影響

2.3.3 凍融次數對玉米抗氧化活性肽穩定性的影響

在質量濃度為2 mg/mL，pH為9.0的條件下，研究不同凍融次數對玉米肽抗氧化活性的影響，以表征玉米抗氧化活性肽的貯藏穩定性，結果如圖7所示。與對照相比，隨著凍融次數的增加，玉米肽的羥基自由基清除率和亞鐵離子螯合率均呈現出穩定狀態，說明玉米抗氧化活性肽具有良好的貯藏穩定性。可能是因為玉米抗氧化活性肽的空間結構簡單，實驗采用的反復凍融條件對肽的氨基酸組成和構象沒有影響，進而玉米肽的抗氧化活性沒有受到損失。

圖7 凍融次數對玉米肽抗氧化活性的影響

3 結論

采用蛋白酶酶系豐富的麥芽粉和酶解效率較高的堿性蛋白酶Alcalase對玉米醇溶蛋白進行兩步水解，確定了兩步水解法制備高抗氧化活性玉米肽的最適條件為：第一步麥芽粉水解，在底物濃度10%、pH 5.5、溫度50 ℃、酶底比30%條件下水解3 h；第二步Alcalase酶解，在底物濃度10%、pH 8.5、溫度60 ℃、酶底比 0.75%條件下水解6 h。同時，玉米抗氧化活性肽具有熱及貯藏穩定性，在中性和堿性條件下穩定，但不耐受酸性條件。兩步水解法既降低了商品用酶制劑的用量，又保證了產物的抗氧化活性，為制備高抗氧化活性玉米肽及其在食品工業中的應用提供了參考。