紫紅曲菌發酵薏米促α-生育酚富集及其發酵動力學模型構建

宋增光 曾海英 秦禮康 朱 怡 毛佳怡

(貴州大學釀酒與食品工程學院1，貴陽 550025)(貴州省植保植檢站2，貴陽 550001)

紫紅曲菌(Monascuspurpureus)是一種小型絲狀腐生真菌，屬紅曲科(Monascaceae)、紅曲霉屬(Monascus)[1]是生產紅曲的特征性微生物。由紅曲霉菌發酵谷物糧食所得的紅曲是我國傳統的藥食兩用食物。紫紅曲菌發酵過程中會產生多種有益的次級代謝產物，富含生育酚、谷維素、Monacolin K、γ-氨基丁酸、麥角固醇、天然植物激素等活性成分[2-4]，具有降脂、降壓、抗氧化和調節機體代謝等功效[5,6]。

薏米是一種藥食兩用的雜糧，含大量營養成分，如多糖、薏苡素、薏苡酯、脂肪酸、多不飽和脂肪酸及多種氨基酸等。據報道薏米及其提取物具有抗氧化、抗癌、抑制肥胖、降血糖、抗炎等功效[7]。還具有降脂降糖、抗癌、抗氧化、抗過敏、提高免疫力等生理活性功能[8,9]。

Huang等[10]利用紫紅曲菌固態發酵葛根和紅曲米的混合基質，發酵后的異黃酮含量和色素強度均高于紅曲米和葛根，且發酵混合物的DPPH、·OH、FRAP和總抗氧化活性也比葛根和紅曲米具有更高的抗氧化能力，主要是由于發酵之后的色素強度和總酚的含量增加的原因。賀圣凌等[2]對紅曲發酵薏苡糠親脂化合物量變規律進行了探究，結果表明紅曲發酵薏苡糠其親脂性化合物主要為α-生育酚和γ-谷維素，且在發酵過程中，兩者含量均明顯增加。楊玉潔等[11]用紅曲霉菌發酵不同雜糧優化后發現親脂性化合物γ-谷維素含量比未發酵的增加了14倍。

本實驗以薏米為發酵底物，以紫紅曲菌(Monascuspurpureus3.4629)作為發酵菌種，以α-生育酚含量為評價指標，采用固態發酵工藝技術[12]，利用響應面優化發酵條件，并通過建立發酵動力學模型研究紫紅曲菌固態發酵薏米產α-生育酚過程中菌體、產物、底物之間的動態定量關系，更準確地對參數進行預測[13]。通過利用實驗室小規模實驗獲得數據設計大規模的發酵工藝過程[14]，為天然α-生育酚的富集提供新思路、新方法和新工藝，同時充分挖掘薏米資源的綜合利用價值，提高其經濟附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米；紫紅曲菌(Monascuspurpureus3.4629):中國普通微生物菌種保藏管理中心。

正己烷(色譜純);α-生育酚標準品(純度99.9%);其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器,HH-B11·600BY電熱恒溫培養箱,TCL-16B高速臺式離心機,安捷倫1260高效液相色譜。

1.3 方法

1.3.1 發酵方法

1.3.1.1 紫紅曲菌孢子懸浮液的制備

制備方法參考楊玉潔等[11]方法，并做適當改進。

1.3.1.2 紫紅曲菌種子液的制備

制備方法和發酵方法參考楊玉潔等[11]方法，并做適當改進。

1.3.2 生物量測定

菌體量測定[15]: 固態發酵時菌絲和基質纏織在一起，直接計量生物量非常困難，一般通過間接法計量。由于氨基葡萄糖是參與構成真菌細胞壁中幾丁質的主要成分，因此用氨基葡萄糖含量可以表征菌體量。

1.3.3 薏米紫紅曲菌固態發酵條件優化

1.3.3.1 薏米紫紅曲菌發酵工藝條件的單因素實驗

以薏米為發酵底物，分別固定料液比(2∶1)、接種量10%、發酵時間10 d，發酵溫度30 ℃。分別考察其料液比、接種量、發酵時間和發酵溫度等單因素對薏仁紅曲霉發酵產α-生育酚的影響，根據單因素實驗結果和實際情況，選出對α-生育酚含量影響顯著的因素進行響應面實驗。

1.3.3.2 薏米紫紅曲菌發酵工藝的響應面優化實驗

綜合發酵過程中各單因素對α-生育酚含量影響的實驗結果，根據Box-Behnken實驗設計原理[16]，選擇對α-生育酚含量有顯著影響的3個因素發酵溫度(A)、接種量(B)、料液比(C)為自變量，以α-生育酚含量(Y)為響應變量，利用Design-Expert 7.0.0軟件進行三因素三水平的響應面實驗優化，實驗因素和水平設計見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

1.3.4 分析檢測

樣品處理:發酵成熟雜糧基質冷凍干燥打粉后精確稱取發酵物2 g，加入5 mL 色譜純正己烷，振蕩混勻，于60 ℃水浴鍋中水浴20 min，8 000 r/min離心15 min，吸取上清液，如此采用正己烷反復提取3次，合并上清液層，利用旋轉蒸發儀蒸干提取液，揮干物中加入1 mL 正己烷，超聲使之溶解完全，8 000 r/min離心10 min，吸取上清液，過0.22 μm濾膜，入進樣瓶。

色譜條件:色譜柱:硅膠柱(SUPELCOSILTM LC-SI)，25 cm×4.6 mm，5 μm。流動相:0.8%乙酸乙酯與 0.8%醋酸溶于正己烷。流速:1.5 mL/min。柱溫:22 ℃。檢測波長:290 nm。進樣量:40 μL。

根據色譜條件對發酵薏米樣品處理液進行HPLC上樣分析，利用保留時間和光譜特征峰作為定性依據，采取峰面積歸一法計算各組成的含量即外標法定量。

1.3.5 動力學模型建立

根據篩選得到的最佳發酵條件，建立紫紅曲菌發酵薏米的菌體生長、產物生成和底物消耗動力學模型，利用紫紅曲菌發酵薏米，每隔 2 d測定其生物量、α-生育酚含量及總糖消耗量，計算出動力學模型的參數，建立動力學方程，預測其在發酵過程中的變化。

1.3.5.1 菌體生長動力學模型的建立

發酵動力學的核心是關于菌體生長的動力學，生態學領域中描述在資源有限條件下種群增長規律的最佳數學模型是Logistic方程[17]。因此，Logistic方程[18]適合真菌的固態培養過程，其數學表達式為:

(1)

以t=0，X=Xm為初始條件，將式(1)積分變形后得式(2)，即:

(2)

式中:X0為菌體的初始生物量，以氨基葡萄糖量表征/OD/g；Xm為菌體的最大生物量/OD/g；μm為最大比生長速率/d-1；t為時間/d。

1.3.5.2 產物生成動力學模型的建立

產物生成速率與細胞生長速率之間的關系有三種類型:產物生成與菌體生長偶聯型、產物生成與菌體生長部分偶聯型及產物生成與菌體生長非偶聯型[19,20]。紫紅曲菌菌體生長與α-生育酚合成之間的關系為部分偶聯型，因此，選擇Leudeking-piret方程[21]作為合成動力學模型，見式(3)。

(3)

式中:P為產物濃度/mg/mL；X為生物量/OD/g；t為時間/d；a為與菌體生長相關聯的產物合成常數；b為與菌體量相關聯的產物合成常數。

將式(1)代入式(3)再積分得到式(4)。

P(t)=P0+c[X(t)-X0]+

(4)

1.3.5.3 底物消耗動力學模型建立

在發酵過程中，底物消耗主要有三個方面:菌體生長、細胞維持生命活動的消耗及生成代謝產物的消耗[22]。從發酵實驗結果可知，底物消耗主要用于菌體生長和維持細胞代謝活動[23]。底物消耗動力學模型使用Dose Resp方程進行擬合[24,25]，模型見式(5)。

(5)

式中：S為底物濃度/g/mL；YX/S為菌體得率系數；YP/S為產物產率系數；Ke為維持系數。在紫紅曲菌固態發酵產α-生育酚的過程中，底物不用于菌體的生長消耗，僅用于產物的合成，因此，為簡化模型，式(5)可簡化為:

(6)

S(t)=S(0)+gP(t)

(7)

再將式(4)代入式(7)中可得到底物消耗動力學擬合方程，見式(8):

(8)

1.3.6 數據處理與分析

所有實驗數據取3 次重復實驗的平均值，采用Origin 8作圖，SPSS Statistics 17.0單因素差異性分析鄧肯檢驗、Design-Expert 7.0.0響應面實驗設計進行數據處理與分析。

2 結果與分析

2.1 薏米紫紅曲菌發酵條件的單因素實驗結果

2.1.1 發酵條件對α-生育酚含量的影響

由圖1可知，α-生育酚含量隨著發酵溫度的變化呈先上升后下降的趨勢。發酵溫度為30 ℃時，菌體生長良好，α-生育酚含量最高，基質顏色呈紫紅色，α-生育酚含量顯著高于其他組(P<0.05)。

圖1可知，當料液比為2∶1時，菌體生長良好，紅曲顏色呈深紅色，此時α-生育酚含量最高。料液比過高發酵熱使得基質水分的散失，菌體的生長代謝受到限制，過低基質透氣性不佳，紅曲菌生長受阻，出現腐敗現象。

接種量大小會影響菌體在培養基中的適應能力從而影響生長速度。適宜的接種量有利于微生物的生長代謝，有利于菌體的增長和次級代謝產物的積累。由圖1可知，當接種量為10%時，α-生育酚含量最高，顯著高于其他組(P<0.05)。

注:顯著性分析字母加粗為溫度，下劃線為接種量，斜體為料液比。

2.1.2α-生育酚最佳收獲期

由圖2可以看出，α-生育酚含量隨著發酵時間的延長呈先升高后平穩的趨勢，第10天時達到最高(P<0.05)，10 d后α-生育酚的含量開始呈緩慢的下降趨勢。梁爽等[26]利用紅曲霉菌發酵秈米，確定收曲時間為9 d，此時桔霉素含量處于較高水平，糖化酶活力，色價均達到最高值。蒲立檸等[27]用紫紅曲菌發酵青稞麩皮薏米基質時發現，產物的最佳收獲期為12 d左右。發酵時間越長，基質營養物質消耗殆盡，大量菌體生長受到抑制或死亡，可能出現惡性厭氧發酵，使α-生育酚結構受到破壞，產量下降。綜合考慮，發酵時間為10 d左右為宜。

圖2 α-生育酚最佳收獲期

2.2 薏米紫紅曲菌發酵條件的響應面實驗結果

在單因素實驗基礎上，采用中心組合實驗設計，選擇對α-生育酚含量影響較大的因素:發酵溫度(A)、接種量(B)、料液比(C)為自變量，固定發酵時間10 d，根據Box-Behnken設計方案進行優化實驗，各因素的實驗組合及結果見表2。

由表2可看出優化后的實驗結果α-生育酚的產量較優化前顯著增加，0水平和1水平對α-生育酚的產量有促進作用，實驗號5、7、10、15四組0水平條件下α-生育酚產量差異不大，誤差較小。

表2 響應面實驗設計與結果

2.2.1 數學模型的建立

利用Design-Expert 7.0.0軟件對表2中的實驗結果進行回歸分析，得到二次回歸模型方差分析結果見表3。對表3中數據進行二次多項回歸擬合，得到α-生育酚含量(Y)對發酵溫度(A)、接種量(B)、料液比(C)的二次多項式回歸方程如下:

Y=12.61+1.99A+2.06B-2.19C-0.25AB+0.24AC-0.15BC-3.03A2-2.89B2-3.06C2

由表3回歸模型系數顯著性檢驗結果可知:模型的一次項A、B、C影響極顯著(P<0.01)。二次項A2、B2、C2影響極顯著(P<0.01)，交互項AB、BC、AC影響不顯著，表明溫度、接種量、料液比對α-生育酚含量交互影響作用不顯著。

表3 二次回歸模型方差分析

2.2.2 響應面分析結果

根據Design-Expert 8軟件響應面分析，可從回歸模型中得到最優工藝條件:料液比2∶1、接種量15%、發酵溫度28 ℃、發酵時間10 d。在該優化條件下，α-生育酚含量的理論值為12.413 6 mg/mL，驗證實驗得出α-生育酚含量達12.067 mg/mL，與預測值接近，說明響應面法對紫紅曲菌發酵薏米工藝條件的優化是可行的。

2.3 紫紅曲菌發酵薏米動力學擬合結果

2.3.1 紫紅曲菌固態發酵薏米動力學曲線

紫紅曲菌固態發酵薏米，發酵過程測定總糖含量、生物量(氨基葡萄糖含量表征)和α-生育酚的含量，結果如圖3所示。可以看出紫紅曲菌生長和α-生育酚合成均呈S型曲線，在接種后紫紅曲菌生長有一段2 d的適應期，菌體量增長緩慢，α-生育酚的合成緩慢，總糖消耗加速，之后進入快速增長期，在8～10 d進入穩定期，10 d時菌體量和α-生育酚的含量都達到最大值，紫紅曲菌已長滿整個薏米培養基，且顏色呈紫紅色，此后進入衰亡期，菌體生長，產物富集開始緩慢減少，總糖消耗趨于完全。

圖3 紫紅曲霉生長和α-生育酚合成曲線圖

2.3.2 菌體生長動力模型擬合結果

在軟件 Origin 8.6 中輸入式(2)的自定義函數，對菌體生物量的實驗值進行非線性擬合，計算各參數的值從而得到動力學方程。由實驗值得到Xm=0.55 OD/g，經擬合可得X0(a)=0.051 OD/g，μm(b)=0.578 9 d-1，代入式(2)中得到菌體生長動力學方程為:

R2=0.954 2

圖4 菌體生長動力學模型擬合曲線

2.3.3 產物生成動力模型擬合結果

利用 Origin8.6 軟件建立式(8)的自定義函數，對產物含量的實驗值進行非線性擬合，計算各參數的值從而得到動力學方程.可得P0(e)=-0.577 7 mg/L，c=15.812 6，d=1.017，代入式(8)中得到產物合成動力學方程為:

R2=0.949

圖5 產物生成動力學模型擬合曲線

2.3.4 底物消耗動力學模型擬合結果

利用 Origin8.6 軟件建立式(8)的自定義函數，對底物含量的實驗值進行非線性擬合，計算各參數的值從而得到動力學方程。可得f=3.6，g=-0.38代入式(8)中得到總糖消耗動力學方程為:

R2=0.125

圖6 底物消耗動力學模型擬合曲線

根據動力學模型擬合結果可以看出:紫紅曲菌發酵薏米動力學實驗值與模型擬合值較為吻合，R2擬合度良好，模型極顯著，能準確反映紫紅曲菌發酵薏米過程中菌體生長、產物合成以及底物消耗的動態變化規律。目前紫紅曲菌固態發酵動力學研究甚少，通過發酵動力學模型可以看出α-生育酚的合成為生長部分偶聯型，生物量與產物合成成正比，菌體生長動力學確定紫紅曲菌發酵薏米的生長快速增長期為4～8 d。利用快速增長期，不斷補充底物延長快速增長期使之實現連續發酵，或者利用快速增長期4～6 d的菌體制作種子，縮短適應期達到縮短生產周期，進一步促進產物的富集，對于工業化生產具有實際指導意義。

3 結論

以紫紅曲菌發酵薏米基質，通過單因素實驗和Box-Behnken響應面優化實驗得出紫紅曲菌固態發酵薏米產α-生育酚的最佳條件為料液比2∶1、接種量15 %、發酵溫度28 ℃、發酵時間10 d，此條件下α-生育酚含量最高，為12.413 6 mg/mL，驗證實驗得出α-生育酚含量達12.067 mg/mL，與預測值接近，優化可行。通過建立菌體生長動力學、產物生成動力學和總糖消耗動力學模型，模擬發酵過程中菌體、產物、底物之間的相互關系和動態變化過程，發酵動力學模型的預測值和實測值擬合效果良好，所建模型能較好反映紫紅曲菌發酵薏米過程中的動力學變化。