糜子麩皮中多酚提取工藝優化及其抗氧化活性

顏飛翔 朱 丹 苗欣月 牛廣財 魏文毅 朱立斌

(黑龍江八一農墾大學食品學院1，大慶 163319)(黑龍江省農產品加工工程技術研究中心2，大慶 163319)(黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院3，大慶 163319)

糜子(PanicummiliaceumL.)又叫稷、黍和糜，屬禾本科黍屬，株高30-100 cm，生長期短，喜溫，耐旱[1]。在我國東北、西北和華北等地均有栽培。糜子的營養價值很高，有“五谷之王”的美譽。糜子果實為穎果，磨米去除皮殼后稱黃米，而糜子麩皮作為糜子加工的副產品，約占糜子質量的20%，但其開發利用程度低，除部分用作釀醋原料或飼料外，大部分被廢棄[2]。糜子麩皮中含有豐富的多酚類物質。植物多酚是由植物次生代謝產生的一類酚羥基化合物，在豆類、蔬菜、水果和谷類植物的葉、皮、根和果實中廣泛存在，被喻為“第七大營養物質”[3,4]。研究表明，植物多酚除了抗氧化作用之外，其本身多樣的結構也使其具有其他的生物活性，如防治老年癡呆[5，6]、抗炎[7]、抑菌[8]、抗腫瘤[9，10]、調節腸道菌群[11]及心血管疾病[12]等功效，且已被廣泛應用于藥品及保健品等領域[13]。

目前，提取植物多酚的方法有很多種，例如溶劑浸提法、超聲輔助提取、酶解提取法、微波輔助提取、超臨界CO2萃取法等等[14-16]。其中，關于糜子皮殼中提取多酚已有一些報道。楊聯芝等[17]采用冰浴均質輔助提取糜子殼中多酚的最佳工藝條件為：丙酮濃度90%，料液比1∶30，提取5次，多酚得率為1.458%；牛偉等[18]研究了糜子皮多酚的水酶法提取工藝，當乙醇溶液pH 4.15，固液比1∶42.5，加酶量1.00%，酶解時間4 h，提取3次時，糜子麩皮酚酸提取率可達1.94 mg/g；王振等[2]通過超聲輔助法提取糜子皮中多酚，得到的最佳條件為：40%乙醇為提取劑，料液比1∶25，超聲功率320 W，在室溫下提取40 min，糜子皮中多酚的平均提取率為9.9mg/g；臧盛等[19]則采用冰浴乳化法和堿化消化后有機溶劑萃取法，對15種糜子殼粉中多酚類物質的含量、組成及抗氧化活性進行研究。結果表明，在15個糜子樣品中殼粉中多酚含量為9.357 3～19.092 9 mg/g，主要以結合酚的形式存在，糜子殼粉中不同存在形式的多酚物質均具有抗氧化活性。

超聲波-微波協同萃取作為一種新技術，解決了單獨超聲波和微波提取的不足，超聲波產生的振蕩能彌補微波傳熱不均的缺陷，而微波的熱能有效地彌補超聲波產熱不足的問題[20]。目前，鮮有超聲波-微波協同萃取方法在糜子麩皮多酚提取中的應用。因此，本研究采取超聲波-微波協同萃取方法，以多酚提取量為考察指標，在單因素實驗的基礎上，通過響應面分析法進一步優化工藝條件，并測定其抗氧化活性，以期為糜子皮殼資源高附加值產品的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糜子麩皮，黑龍江省肇源縣產龍黍23品種，礱米后的副產物；福林酚試劑、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)；無水乙醇、無水碳酸鈉、維生素C等均為分析純。

1.2 儀器與設備

GY-FS-02多功能高速粉碎機，XH-300A型電腦微波超聲波合成/萃取儀，L420臺式低速離心機，UV-1100紫外可見分光光度計，RE 3000 A旋轉蒸發儀，SHZ-D(Ⅲ)真空泵。

1.3 方法

1.3.1 單因素實驗設計

考察液料比、乙醇體積分數、提取溫度、超聲波功率、提取時間、微波功率各自對糜子麩皮多酚提取量的影響[21]。選取液料比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1[16,21]，乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%[22]，提取溫度45、55、65、75、85 ℃[22]，超聲波功率400、600、800、1 000、1 200 W[21,23]，提取時間5、10、15、20、25 min[24]，微波功率200、400、600、800、1 000 W[21,23]，進行單因素實驗。通過計算糜子麩皮多酚提取量，確定響應面分析實驗的因素水平范圍，優化工藝條件。

1.3.2 響應面實驗設計

在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken的中心組合實驗設計原理，選取選取液料比、乙醇體積分數、提取溫度和超聲波功率4個因素為自變量，以多酚提取量為響應值，采用四因素三水平的響應面分析方法，因素與水平編碼見表1。

表1 響應面實驗因素與水平表

1.3.3 標準曲線的制作

稱取25 mg沒食子酸用蒸餾水溶解，定容至25 mL，得質量濃度為1 mg/mL沒食子酸標準液，分別準確吸取標準液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，用蒸餾水定容至5 mL，得到濃度梯度為0、80、160、240、320、400 μg/mL的標準溶液。準確吸取250 μL各標準液于試管中，再加入1 mL蒸餾水和250 μL福林酚試劑，搖勻，反應6 min后加入2.5 mL 7% Na2CO3，再加入2 mL蒸餾水，室溫下避光放置1.5 h后，測定765 nm處的吸光值。以沒食子酸濃度為橫縱標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。線性回歸后得到沒食子酸濃度與吸光值的方程為：y=0.003 8x+0.074 5，R2=0.994 7。

1.3.4 糜子麩皮中多酚含量的測定

吸取250 μL提取液于試管中，再加入1 mL蒸餾水和250 μL福林酚試劑，搖勻，反應6 min后加入2.5 mL 7% Na2CO3，再加入2 mL蒸餾水，室溫下避光放置1.5 h后，測定765 nm處的吸光值。通過標準曲線方程計算出提取液中多酚的質量濃度，并依照式(1)計算糜子麩皮中多酚提取量，以每克糜子麩皮粉中的沒食子酸質量(毫克)表示。

(1)

式中：C為多酚濃度/mg/mL；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數；M為樣品質量/g。

1.3.5 糜子麩皮多酚體外抗氧化活性測定1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測定

取2 mL樣品多酚提取液，分別加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液 2 mL，溫室避光反應30 min，于517 nm處測定反應溶液的吸光度值[25]。按式(2)計算清除率，其中：A0為樣品溶液用等體積的無水乙醇代替測定的吸光度值；Ai為樣品溶液的吸光度值；Aj為DPPH溶液用等體積的無水乙醇代替測定吸光度值。

(2)

1.3.5.2 羥自由基清除率的測定

分別取不同濃度樣品，加入2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液、2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液，搖勻靜置10 min后，加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸溶液，搖勻，37 ℃恒溫水浴1 h，在510 nm下測定吸光度值A1，以蒸餾水為參比溶液，測定吸光度值A0，以同體積的蒸餾水代替水楊酸溶液，測定吸光度值A2[26]。按式(3)計算羥自由基清除率。

(3)

1.3.5.3 超氧自由基清除率的測定

取4.5 mL Tris-HCl(pH 8.2)緩沖液于試管中，在20 ℃水浴預熱20 min后，分別加入不同濃度的多酚樣品溶液0.1 mL和25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，搖勻后用蒸餾水補充至10 mL。置于25 ℃水浴反應5 min，取出后立即加入1 mL 8 mol/L HCl，于325 nm處的吸光度Ai。空白以蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度A0；考慮到樣品液本底的影響，同時測定不加鄰苯三酚溶液的相同濃度的樣品溶液的吸光度Aj[27]。按式(4)計算超氧自由基清除率。

(4)

1.3.5.4 還原力的測定

取30 μL不同濃度的樣品，加入0.2 mol/mL磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2.5 mL和1%鐵氰化鉀2.5 mL，混合均勻，于50 ℃恒溫水浴中反應30 min后急速冷卻，取出再加入10%三氯乙酸2.5 mL。然后取2.5 mL上清液，加蒸餾水2.5 mL，加0.1%三氯化鐵0.5 mL，混勻。以蒸餾水為參比溶液于700 nm處測定吸光值[28]。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 糜子麩皮中多酚提取的單因素實驗結果

由圖1a可知，隨著液料比的增大，糜子麩皮多酚的提取量逐漸升高，當液料比增大到40∶1時，提取量最大。濃度差是浸出成分在擴散階段的主要推動力，隨著提取溶劑用量的增加，提高了濃度差，加強了傳質推動力，從而增加了糜子麩皮中多酚的提取量[29]。繼續增加溶劑用量，糜子麩皮多酚提取量稍有增加，但是增加量不大，考慮到溶劑成本以及后續蒸發濃縮的便利，液料比以40∶1左右為宜。

圖1 單因素實驗結果

隨著乙醇體積分數的增大，糜子麩皮多酚提取量逐漸增大，可能是因為在乙醇體積分數較低時，乙醇可以破壞細胞壁進入細胞內部將酚類物質溶出，當乙醇體積分數達到60%時，糜子麩皮多酚提取量達到最大；但當乙醇體積分數繼升高時，提取量反而下降，主要是因為乙醇會引起蛋白質變性在細胞壁形成致密結構而阻礙酚類物質的溶出[30]。因此，乙醇體積分數以60%為宜。

糜子麩皮多酚的提取量隨浸提溫度的升高而逐漸升高。溫度升高時，分子運動加快，氫鍵更容易斷裂，有利于多酚類物質的滲透和擴散。在85 ℃時提取量達到最大值。但是，此時已經高于乙醇沸點，會導致溶劑揮發，并且溫度越高，會越加大多酚氧化的可能性。因此，選擇適宜的溫度為75 ℃。

由圖1b可知，糜子麩皮多酚提取量隨著超聲波的功率的增大呈現先上升后下降的趨勢。超聲波功率越大，其空化作用和機械作用就越強，細胞組織被分解的更加徹底，粒子運動不斷加快，從而有助于多酚物質的溶出，在功率為1 000 W時提取量最高，而后提取量則下降。這可能與大功率的輻射使部分多酚類物質受到破壞，發生降解有關。因此，超聲波功率以1 000 W為宜。

當提取時間為10 min 時，糜子麩皮多酚提取量達到最大；當提取時間再延長時，提取量則有所下降，這可能是由于過長時間的超聲波-微波的協同作用會破壞多酚結構，同時伴隨多酚的部分氧化，從而使提取量降低。因此，適宜的提取時間為10 min。

不同微波功率對糜子麩皮多酚提取量影響較小。微波功率越大，越有助于物料內部升溫。分子之間劇烈碰撞產生的大量摩擦熱導致局部壓力變大，迫使細胞破裂，從而有利于內容物的釋放。當微波功率為200 W時，得到了較高的多酚提取量。在200 W之后，糜子麩皮多酚的提取量減少，這可能是由于微波功率上升產生的局部過熱破壞了部分多酚的結構，致使多酚的提取量下降[31]。從本實驗結果來看，選擇微波功率200 W為宜。

微波功率對于糜子麩皮多酚的提取量的影響較小，考慮到能源消耗和經濟成本，不再對其進一步優化。而對于因素提取時間來說，在10 min時已經達到較高的提取量，之后隨著時間延長一直呈下降趨勢。因此，也不再對其進一步優化。

2.2 響應面優化實驗

2.2.1 響應面實驗結果

以糜子麩皮多酚提取量為響應值，以A液料比、B乙醇體積分數、C提取溫度、D超聲波功率進行四因素三水平中心組合實驗，結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗設計及結果

2.2.2 響應面回歸方程的建立及方差分析

用Design-Expert 8.0.6數據處理軟件對響應面實驗結果進行分析，得到二次回歸模型方程為：

Y=7.51+0.57A+0.033B+0.45C+0.059D+0.042AB+0.17AC+0.22AD+0.060BC-0.027BD+0.15CD-0.13A2-0.43B2+0.26C2-0.21D2

對模型方程進行方差分析，分析結果見表3。

表3 回歸方差分析表

由表3可以看出，F模型=18.91，P模型<0.01，說明上述建立的模型顯著；F失擬項=2.65，P失擬項=0.180 6>0.05，失擬項不顯著，說明可以用本實驗的二次回歸方程對響應值進行預測。決定系數R2=0.949 8，說明理論值與實際值擬合良好。通過比較F值的大小可知，各因素對糜子麩皮多酚提取量的影響大小分別為：液料比(A)>提取溫度(C)>超聲波功率(D)>乙醇體積分數(B)。各因素的二次項中，除了因素A2項外，其余因素的二次項對糜子麩皮多酚的提取量均有顯著影響。交互項中，AD的P<0.05差異顯著，說明液料比與超聲波功率之間的交互作用顯著。

2.2.3 驗證性實驗

響應面實驗預測的最佳提取條件為：在液料比50∶1，乙醇體積分數61.28%，溫度75 ℃，超聲波功率1 000 W。考慮到實際操作，將結果調整為：液料比50∶1，乙醇體積分數60%，提取溫度75 ℃，超聲波功率1 000 W，微波功率為200 W，提取時間10 min。在此條件下，多酚提取量理論預測值為9.06 mg/g。通過實驗證實，提取量為8.92 mg/g，與理論值一致。實驗結果與模型符合良好，說明該模型能較好地預測糜子麩皮中多酚提取量。

2.3 糜子麩皮多酚抗氧化活性分析

由圖2可知，在質量濃度為0.4～2.0 mg/mL的濃度范圍內，糜子麩皮多酚對DPPH自由基清除率隨著質量濃度的增加而逐漸增加，當樣品質量濃度為2.0 mg/mL時，對DPPH自由基清除率可達92.41%，略低于1 mg/mL的VC清除率(95.40%)。經計算，糜子麩皮多酚的清除DPPH自由基的IC50值為0.006 mg/mL。

圖2 糜子麩皮多酚抗氧化結果

當質量濃度小于0.7 mg/mL時，該多酚對于羥自由基的清除率增加緩慢，當質量濃度大于0.7mg/mL時，該多酚對羥自由基的清除率達到了最大值，為69.22%。但是，該多酚對羥自由基的清除率要低于1 mg/mL的VC清除率(92.97%)。經計算，糜子麩皮多酚清除羥自由基的IC50值為0.142 mg/mL。

不同質量濃度的糜子麩皮多酚對超氧自由基的清除能力較低，在質量濃度為0.1～0.9 mg/mL的濃度范圍內，該多酚對超氧自由基清除率隨著質量濃度的增加而增加，當達到0.9 mg/mL時，清除率為24.41%，遠低于1 mg/mL的VC清除率(94.46%)。經計算，糜子麩皮多酚的清除超氧自由基的IC50值為12.048 mg/mL。

在質量濃度為0.1～0.9 mg/mL的濃度范圍內，糜子麩皮多酚的還原力隨著樣品濃度的增加而增加，與濃度有較好的線性關系。當達到0.9 mg/mL時，OD700為0.689，低于1 mg/mL的Vc吸光值1.422。經計算，糜子麩皮多酚的還原力IC50值為4.022 mg/mL。

糜子麩皮多酚含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧自由基清除率和還原力的相關系數r與p值如表4所示。由表4可知，除羥自由基清除率與多酚呈顯著正相關(P<0.05)外，DPPH自由基清除率、超氧自由基清除率和還原力與多酚均呈極顯著正相關(P<0.01)。表明糜子麩皮多酚與抗氧化活性之間密切相關，這與臧盛等[19]認為糜子殼粉中不同存在形式的多酚物質均具有抗氧化活性的結果相一致。

表4 抗氧化活性與多酚的Pearson相關分析結果

3 結論

采用超聲波-微波協同方法提取糜子麩皮中的多酚，應用Box-Behnken中心組合實驗設計進行工藝優化，最終確定最佳工藝條件為：液料比50∶1，乙醇體積分數60%，提取溫度75 ℃，超聲波功率1 000 W，微波功率為200 W的條件下提取10 min。在此工藝條件下，糜子麩皮中多酚的提取量為8.92 mg/g，與理論值9.06 mg/g接近，說明該提取工藝準確度高、重復性好，可用于糜子麩皮中多酚的提取。抗氧化活性實驗表明，該多酚對DPPH自由基清除率，羥自由基清除率，超氧自由基清除率和還原力的IC50值分別為0.006、0.142、12.048、4.022 mg/mL，并且各個抗氧化活性指標和糜子麩皮多酚間均呈顯著正相關(P<0.05)。