梭魚草化感物質丁二酸、肉桂酸及香草酸對銅綠微囊藻生長的抑制效應

趙 楚，錢燕萍,2，田如男

（1.南京林業(yè)大學 風景園林學院，江蘇 南京 210037；2.南京曉莊學院 環(huán)境科學學院，江蘇 南京 210000）

水體富營養(yǎng)化導致水華頻繁爆發(fā)，影響水體景觀，引起水質惡化，最為常見的藍藻水華還會產生多種天然毒素。傳統(tǒng)的物理控藻、化學控藻方式存在成本高昂、易造成二次污染等問題[1?3]，利用水生植物改善治理水體問題成為當前研究的主要方向。20世紀70年代，RICE[4]提出了化感作用的概念，即植物或微生物通過釋放化學物質到周邊環(huán)境中而產生的對其他植物或者微生物直接或間接的有害作用。近年來，國內外學者對植物釋放的常見化感抑藻物質進行了大量研究，其中酚酸與脂肪酸是最常見的2種類型[5]，如NAKAI等[6]從狐尾藻Myriophyllumspicatum中分離鑒定出鞣花酸、沒食子酸、鄰苯二酚酸、(+)-兒茶素4種酚酸，其聯(lián)合作用對銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa產生協(xié)同生長抑制；陳國元等[7]從黃菖蒲Irispseudacorus中提取有機酸組分對銅綠微囊藻生長抑制顯著，鑒定出15種脂肪酸類物質和9種酚酸類物質；高云霓等[8]證實苦草Vallisneriaspiralis種植水中的酚酸組分對銅綠微囊藻生長具有抑制作用，進一步鑒定出阿魏酸等9種酚酸類物質，并提出不同種類酚酸的聯(lián)合作用可能是水生植物抑藻的重要機制。梭魚草Pontederiacordata是園林中廣泛應用的水生觀賞植物，不僅能去除污染水體中的總氮、總磷[9]，還可以有效抑制有害藻類生長[10]，在凈化污水、防止水華等方面表現(xiàn)出很好的應用潛力。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梭魚草根狀莖水浸提液對銅綠微囊藻抑制效果最佳，并從中提取鑒定出多種有機酸類物質，篩選出梭魚草根狀莖中含量較高、抑藻效果較好的丁二酸、肉桂酸、香草酸[11]。因此本研究對這3種化感物質單一及聯(lián)合作用對藍藻主要藻種——銅綠微囊藻的抑制效果進行研究，以期探究梭魚草根狀莖有機酸類化感物質對藍藻的抑制機理，為推廣梭魚草在凈化水體方面的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 供試材料

銅綠微囊藻屬于藍藻門Cyanophyta色球藻科Chroococcaceae微囊藻屬Microcystis，購于中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫，編號為FACHB-315。銅綠微囊藻培養(yǎng)于BG-11培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度(25±1) ℃、光暗比12 h/12 h，光照強度2 500 lx，定時震蕩3次·d?1，培養(yǎng)至對數(shù)增長期時用于實驗。

在梭魚草根狀莖中分離鑒定出11種有機酸類化感物質，選擇抑藻效果較強的丁二酸、肉桂酸、香草酸，采用其標準品模擬進行抑藻實驗，標準品純度≥99.5%。上述化學試劑與二甲亞砜均由國藥集團化學試劑有限公司生產。

1.2 實驗設計

1.2.1 單一有機酸化感物質對銅綠微囊藻的抑制作用 依據(jù)預實驗結果，丁二酸、肉桂酸的質量濃度梯度分別設置為0 (對照)、20、40、50、60、80、100 mg·L?1，香草酸的質量濃度梯度設置為0 (對照)、20、40、60、80、100、120 和 150 mg·L?1，吸取上述物質各 100 μL 分別添加至 100 mL 銅綠微囊藻藻液中[D(650)=0.15]。所有處理均重復3次。每24 h采用紫外分光光度計測定藻細胞D(650)，計算抑藻率。

1.2.2 有機酸化感物質聯(lián)合對銅綠微囊藻的抑制作用 根據(jù)前期研究結果[11]，將丁二酸和肉桂酸以1∶1的質量濃度比例二維混合，丁二酸和香草酸、肉桂酸和香草酸均以1∶2的質量濃度比例二維混合，丁二酸、肉桂酸和香草酸以1∶1∶2的質量濃度比例三維混合。設置混合后的質量濃度梯度為0 (對照)、20、40、60、80、100 mg·L?1，吸取上述物質各100 μL分別添加至100 mL銅綠微囊藻藻液中[D(650)=0.15]。所有處理均重復3次。每24 h測定藻細胞D(650)，計算抑藻率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 抑藻率計算 各處理對銅綠微囊藻生長抑制率的計算公式為：IR=(1?N/M)×100%。其中：IR為抑制率；N為第t天處理組的藻細胞D(650)；M為第t天對照組的藻細胞D(650)；IR為正值表示抑制藻細胞生長，負值表示促進藻細胞生長。采用Excel 2010和SPSS 19.0進行計算和統(tǒng)計分析。在方差分析顯著的基礎上，用Duncan法進行比較檢驗。

1.3.2 半抑制質量濃度(CE50)計算方法 采用SPSS 19.0軟件，通過概率單位法(Probit過程)計算各個化感物質聯(lián)合作用于藻類72 h的CE50[12]。

1.3.3 聯(lián)合作用評價方法 采用毒性單位法[13]和相加指數(shù)法[14]對有機酸類化感物質抑制銅綠微囊藻生長的效應進行評價。①毒性單位法(UT)。規(guī)定混合物中第i組分的毒性單位為：UTi=Ci/CL50,i。其中：Ci為混合物中i組分的質量濃度，CL50,i為i組分單獨作用時的半致死質量濃度。M與M0為評價毒性效應的相加指數(shù)，對于一個N組分的混合物來說，混合物的毒性單位UTmix等于各組分毒性單位之和(M)，即：。若令，M0=M/(UTi)max，則當M=1時，為相加作用；當M＞M0時，為拮抗作用；當M＜1時，為協(xié)同作用；當M=M0時，為無相加或獨立作用；當M0＞M＞1時，為部分相加作用，其中(UTi)max表示混合物中各組分毒性單位的最大值。②相加指數(shù)法(AI)。相加指數(shù)法(AI)是在毒性單位概念的基礎上提出的，定義如下：當M=1時，IA=M?1；當M＜1時，IA=1/M?1；當M＞1時，IA=1?M。其中，IA為相加指數(shù)。IA的評價標準如下：當IA=0時，為簡單的相加作用；當IA＜0時，為拮抗作用；當IA＞0時，為協(xié)同作用。

2 結果與分析

2.1 單一有機酸化感物質處理對銅綠微囊藻生長的影響

通過方差分析和多重對比(圖1)可知：處理質量濃度與處理時間對3種化感物質抑藻效果均有顯著影響(P＜0.05)。丁二酸、肉桂酸、香草酸單一作用于銅綠微囊藻時，初期均呈現(xiàn)出“低促高抑”的現(xiàn)象，香草酸尤為顯著。處理第1天時，低質量濃度(≤60 mg·L?1)丁二酸、肉桂酸及香草酸處理均能夠在不同程度上促進銅綠微囊藻的生長。不同質量濃度肉桂酸、丁二酸、香草酸對銅綠微囊藻的生長均具有顯著差異(P＜0.05)，隨著質量濃度升高，抑藻能力逐漸增強。香草酸低質量濃度處理對銅綠微囊藻的生長幾乎沒有抑制作用，肉桂酸低質量濃度處理抑藻效果最佳，20 mg·L?1處理7 d時抑藻率達77.86%。3種有機酸處理隨著時間的延長抑藻作用整體先上升后穩(wěn)定。60、80 mg·L?1的香草酸處理以及20、40 mg·L?1的丁二酸處理的抑制率隨時間延長呈先上升后下降的趨勢，肉桂酸所有處理抑藻率均隨時間上升，處理7 d時各質量濃度抑藻率最大差值僅為7.56%。處理第7天，丁二酸、肉桂酸質量濃度為100 mg·L?1、香草酸質量濃度為150 mg·L?1時抑藻率達到最高，分別為87.42%、85.42%和86.95%。

2.2 有機酸化感物質聯(lián)合處理對銅綠微囊藻生長的影響

由圖2可見：當丁二酸、肉桂酸和香草酸以二維方式聯(lián)合作用于銅綠微囊藻時，各處理組抑藻效果隨著處理質量濃度的升高及處理時間的延長而逐漸升高，差異達極顯著水平(P＜0.01)。丁二酸+肉桂酸不同質量濃度處理均具有抑藻效果，而低質量濃度丁二酸+香草酸與肉桂酸+香草酸處理在實驗前期具有促進銅綠微囊藻生長的作用，20 mg·L?1處理中肉桂酸+香草酸第5天抑藻率最高，為20.73%。丁二酸+香草酸處理實驗期間各質量濃度抑藻率始終差異顯著(P＜0.01)。隨著時間延長，丁二酸+香草酸與丁二酸+肉桂酸抑藻率呈先上升后穩(wěn)定的趨勢，肉桂酸+香草酸呈先上升后下降的趨勢。處理第7天，丁二酸+肉桂酸、丁二酸+香草酸質量濃度為100 mg·L?1時，其抑藻率最高，分別為92.78%、84.81%；處理第6天，肉桂酸+香草酸質量濃度為100 mg·L?1，其抑藻率最高，為77.94%。

當3種有機酸以三維方式聯(lián)合作用于銅綠微囊藻時，處理質量濃度和處理時間對抑藻率的影響差異達到極顯著水平(P＜0.01)。20 mg·L?1的處理僅在第1天對銅綠微囊藻的生長具有抑制效果，其他質量濃度處理均具有明顯的抑藻效果，40 mg·L?1處理在第 2天抑制率達 46.37%，為最大，60、80 mg·L?1處理在第3天抑制率最大，為53.45%和61.76%，處理第7天，處理質量濃度為100 mg·L?1時，其抑藻率最高，為89.99%。隨著時間延長，40、60、80 mg·L?1處理抑制效果先上升后下降，100 mg·L?1處理抑藻率上升且 2～4、6～7 d 差異不顯著。

圖 1 肉桂酸(A)、丁二酸(B)、香草酸(C)對銅綠微囊藻生長的影響Figure 1 Effects of cinnamic acid (A), succinic acid (B), vanillic acid (C) on the growth of M.aeruginosa

2.3 有機酸化感物質對銅綠微囊藻毒性效應的評價

經肉桂酸、丁二酸和香草酸分別處理72 h時，對銅綠微囊藻的半致死質量濃度分別為52.95、54.32和106.00 mg·L?1，此時這3種有機酸類化感物質抑藻能力大小為肉桂酸＞丁二酸＞香草酸。丁二酸+肉桂酸、丁二酸+香草酸、肉桂酸+香草酸、丁二酸+肉桂酸+香草酸處理在實驗第72小時的半致死質量濃度分別為51.03、78.69、52.84和59.04 mg·L?1，此時這3種有機酸類化感物質聯(lián)合作用的抑藻能力大小依次為丁二酸+肉桂酸＞肉桂酸+香草酸＞丁二酸+肉桂酸+香草酸＞丁二酸+香草酸。此外，由表1和表2可知：采用毒性單位法和相加指數(shù)法對銅綠微囊藻聯(lián)合作用的評價結果均是協(xié)同作用。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)：利用丁二酸、肉桂酸、香草酸單獨作用于銅綠微囊藻初期均會導致抑制率出現(xiàn)“低促高抑”的現(xiàn)象，劉曉宇等[15]、YAN等[16]研究中也觀察到了相似的現(xiàn)象，這可能是因為低質量濃度的丁二酸、肉桂酸、香草酸可以一定程度上改變藻細胞膜透性，使細胞更易從外界獲得營養(yǎng)物質[17]。然而，較高質量濃度有機酸則會明顯抑制銅綠微囊藻的生長，研究期間觀察到的藻液顏色逐漸變淡可以證明，可能是較高質量濃度有機酸超過了藻細胞膜的承受閾值，導致藻細胞膜結構被破壞，細胞膜破裂，細胞內溶物大量外滲[18]。

圖 2 有機酸化感物質聯(lián)合處理對銅綠微囊藻生長的影響Figure 2 Effects of combined succinic acid, cinnamic acid and vanillic acid on the growth of M.aeruginosa

表 1 利用毒性單位法評價有機酸聯(lián)合對銅綠微囊藻的毒性效應Table 1 Results of toxic unit on the joint effects of the mixture of organic acids on M.aeruginosa

表 2 利用相加指數(shù)法評價有機酸聯(lián)合對銅綠微囊藻的毒性效應Table 2 Results of additive index on the joint effects of the mixture of organic acids on M.aeruginosa

為獲得在生存環(huán)境中的競爭優(yōu)勢，植物往往向環(huán)境中分泌多種化感物質。陳國元等[7]研究發(fā)現(xiàn)：黃菖蒲水浸提液中含有丁酸、辛酸、戊酸等，均被證實具有較強抑藻能力。NAKAI等[19?20]從穗花狐尾藻中提取的鞣花酸、沒食子酸兒茶酚均能抑制銅綠微囊藻的生長。INDERJIT等[21]認為，幾乎所有的化感作用都是多種化感物質聯(lián)合作用的結果，這種聯(lián)合作用可以強化化感作用效果。同時，結構類似的同類化感物質聯(lián)合作用抑藻存在協(xié)同或相加效應[22?23]。本研究中，丁二酸屬于脂肪酸類，肉桂酸與香草酸為酚酸類，3種化感物質以二維、三維方式聯(lián)合對銅綠微囊藻生長的抑制作用均表現(xiàn)為協(xié)同效應，與倪利曉等[12]在酚酸與不飽和脂肪酸聯(lián)合作用對銅綠微囊藻生長影響上的研究結果類似，表明脂肪酸與酚酸化感物質聯(lián)合處理能夠有效增強其對銅綠微囊藻的抑制效果。本研究證實3種化感物質單一及聯(lián)合作用抑藻能力從高到低依次為丁二酸+肉桂酸、肉桂酸+香草酸、肉桂酸、丁二酸、丁二酸+肉桂酸+香草酸、丁二酸+香草酸、香草酸。肉桂酸、丁二酸單一作用時抑藻效果最好，二者聯(lián)合作用抑藻能力最強。肉桂酸抑藻效果強于丁二酸，二者分別與香草酸聯(lián)合時，肉桂酸+香草酸的抑藻效果更佳。由此說明單一作用時抑藻效果較好的化感物質進行聯(lián)合作用時抑藻效果也相對較好。丁二酸+肉桂酸+香草酸抑藻效果明顯弱于丁二酸、肉桂酸單一及聯(lián)合作用單一作用時抑藻效果，可能是香草酸抑藻能力最差，在聯(lián)合作用時會削弱整體的抑藻效果。這與GAO等[23]的研究結果相一致，表明抑藻活性較差的化感物質會削弱梭魚草根狀莖有機酸化感物質聯(lián)合抑藻效果。丁二酸、肉桂酸單一作用時抑藻能力相當，但二者分別與香草酸聯(lián)合作用時，表現(xiàn)為肉桂酸+香草酸的抑藻效果遠低于丁二酸+香草酸，這可能是因為同種類的化感物質聯(lián)合抑藻效果更佳。

半抑制質量濃度表示一定時間銅綠微囊藻被半數(shù)抑制的毒物質量濃度。高云霓等[8]發(fā)現(xiàn)：香草酸處理72 h對銅綠微囊藻的EC50約60 mg·L?1；張庭廷等[24]發(fā)現(xiàn)：肉桂酸處理6 d對銅綠微囊藻與蛋白核小球Chlorellapyrenoidosa混合體系的半抑制質量濃度為89.34 mg·L?1，與本研究結果存在明顯的差異，這可能與植物種類、藻類初始質量濃度、處理時間等因素有關。同時，梭魚草根狀莖分泌的丁二酸、肉桂酸、香草酸含量明顯低于其對銅綠微囊藻的半抑制質量濃度，這與NAKAI等[6]的結論相一致。即便水體中可檢測到的化感物質很低，但其控藻效果極佳，這可能與植物化感作用方式有關。低劑量持續(xù)作用可能是水生植物抑藻作用的重要機理[25]。除此之外，通過不同聯(lián)合作用，在降低單個物質作用劑量以達到更好的抑藻效果可能是植物化感抑藻作用的重要機制[12]。但是，多種化感物質共同作用于藻類時，其作用機理比單一種類化感物質更為復雜[26]。這也是自然條件下植物釋放化感物質作用于藻類的方式，化感物質的種類、質量濃度及環(huán)境條件等均會影響聯(lián)合作用效果，因此聯(lián)合處理對藻生長的作用機制值得進一步探究。同時，3種化感物質的抑藻效果顯著，具有開發(fā)為抑藻劑的潛質，但其作為抑藻制劑的生態(tài)安全性也有待深入研究。

除此之外，一些研究表明自然界中梭魚草化感物質含量雖然遠低于實驗室所得半抑制質量濃度，但仍然能有效抑制藻類。張景雯等[9]研究發(fā)現(xiàn)：共培養(yǎng)條件下梭魚草植株在試驗期間對重度污染水的銅綠微囊藻平均抑制率超過70%。田如男等[11]通過共培養(yǎng)以及種植水處理的方式，證實梭魚草均能有效控制銅綠微囊藻、斜生柵藻Scenedesmusobliqnus和小球藻Chlorellavulgaris的生長。表明梭魚草具有控制水華的能力，存在開發(fā)為凈化水體植物的潛力，所以有關梭魚草在自然水體中的控藻方式及應用方法值得進一步探索。