紙基微流控?cái)?shù)碼成像法快速測(cè)定金銀花中綠原酸含量

孔京華，樂 薇，于 敏，段鳳琪，耿 哲，劉詩(shī)詩(shī)，譚宋杰

(武漢工商學(xué)院 環(huán)境與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430065)

1 引言

綠原酸是一種非常重要的活性物質(zhì)，現(xiàn)代科學(xué)對(duì)綠原酸的研究已經(jīng)深入到食品、保健和日用化工等多個(gè)領(lǐng)域[1]。在衛(wèi)生部《藥品標(biāo)準(zhǔn)》中，明確指出170種具有抗菌消炎、清熱解毒的中成藥均含有綠原酸且為主要成分[2]；在食品行業(yè)，綠原酸具有抗氧化穩(wěn)定性和增香、保色等作用[3]，可廣泛應(yīng)用于食品和果品保鮮；在日用化工行業(yè)現(xiàn)已有許多添加綠原酸的防曬護(hù)膚品[4]。

在綠原酸及其相關(guān)產(chǎn)品的研究及生產(chǎn)中，綠原酸的檢測(cè)是極其重要的環(huán)節(jié)。目前綠原酸的檢測(cè)方法多種多樣，如分光光度法、薄層層析—紫外分光光度法[5]、高效液相色譜法等方法，上述方法所需使用到的儀器昂貴且檢測(cè)所需耗材費(fèi)用相對(duì)較高，對(duì)測(cè)定環(huán)境要求高且主要適合在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)，不適于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)。基于這些因素限制了對(duì)綠原酸的進(jìn)一步研究。目前國(guó)內(nèi)外都在不斷探索綠原酸的提取和合成方法，其成果也非常顯著，這就對(duì)綠原酸的檢測(cè)手段和方法有了更高的要求。因此本研究提出一種新型綠原酸含量檢測(cè)方法—微流控紙芯片法。

微流控紙芯片法是當(dāng)前微全分析系統(tǒng)發(fā)展的熱點(diǎn)，以紙張為制作材質(zhì)的紙質(zhì)微流控芯片(簡(jiǎn)稱紙芯片)，是一種新型微尺度分析器件[6]。利用特定材質(zhì)在紙上制作疏水邊界，將被測(cè)流體限定在預(yù)設(shè)的親水區(qū)域內(nèi)，引導(dǎo)流體流入檢測(cè)區(qū)與預(yù)加的反應(yīng)劑進(jìn)行接觸反應(yīng)。上述紙芯片有以下優(yōu)點(diǎn)，分析速度極快，可在數(shù)秒或數(shù)十秒時(shí)間內(nèi)自動(dòng)完成測(cè)定、分離或其他更復(fù)雜的操作，分析和分離速度比常規(guī)宏觀分析法快一到兩個(gè)數(shù)量級(jí)；試樣與試劑消耗量極少，這既降低了分析費(fèi)用和貴重生物試樣的消耗，也減少了環(huán)境污染，是綠色分析技術(shù)；便攜且應(yīng)用廣泛[7]，由于將微通道網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和其他功能單元集成在一個(gè)幾平方厘米的芯片上，因此易制成功能齊全的便攜式儀器，用于各類現(xiàn)場(chǎng)分析。

數(shù)碼成像比色法是基于數(shù)碼設(shè)備上獲得的顏色數(shù)值完成定量分析的一種新方法[8]。該方法利用數(shù)碼相機(jī)、智能手機(jī)等采集設(shè)備記錄與待測(cè)成分濃度直接相關(guān)的顏色并通過(guò)一定方式將顏色的深淺進(jìn)行灰度值或RGB值等數(shù)值化進(jìn)行表示[9]，具有簡(jiǎn)便快捷、可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速定量測(cè)定的優(yōu)勢(shì)。

因此本研究基于數(shù)碼成像法的原理，制作綠原酸快速測(cè)定紙芯片[10，11]，并結(jié)合智能手機(jī)的數(shù)碼成像功能[12]，開發(fā)的一種紙基微流控?cái)?shù)碼成像法，為綠原酸含量快速測(cè)定提供新的思路。

2 材料與方法

2.1 材料

三氯化鐵(分析純) 天津市雙船化學(xué)試劑廠；綠原酸(標(biāo)準(zhǔn)品) 春秋制藥公司 ；甲醇(分析純) 天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；石蠟(分析純) 中國(guó)石油天然氣股份有限公司；正庚烷(分析純) 天津市大茂化學(xué)試劑廠；金銀花(當(dāng)季) 毫州市國(guó)藥中藥材飲片有限公司；定性濾紙(中速) 杭州通用電氣生物科技有限公司；所有實(shí)驗(yàn)用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 儀器

40目篩 上虞市龍翔精密儀器廠；YP202N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；四兩裝中藥材粉碎機(jī)浙江省瑞安市飛達(dá)藥材器械廠；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司； 0.1～2.5 μL移液器BIOHIT(百得)實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；小米MI 9 SE智能手機(jī)小米科技有限責(zé)任公司；高效液相色譜儀 島津公司。

2.3 試驗(yàn)方法

2.3.1 紙基微流控芯片的設(shè)計(jì)

疏水膠帶法制備紙基微流控芯片是取一定長(zhǎng)度寬膠帶，在膠帶兩頭用膠帶固定在白色濾紙上，取一定大小的濾紙，用6 mm打孔器打孔獲得圓形濾紙，取6 mm的圓型濾紙每隔5 mm粘貼于膠帶上，以寬膠帶為疏水基底[13]，獲得陣列檢測(cè)紙芯片(圖1)。

圖1 疏水膠帶法紙基微流控芯片示意

2.3.2 紙芯片拍照取色

自制封閉式長(zhǎng)方體白色泡沫拍攝箱(長(zhǎng)：30.0 cm，寬：20.0 cm，高：23.7 cm，內(nèi)鋪有A4白紙，手機(jī)攝像頭與紙芯片的位置距離為10 cm，光源與紙芯片的距離為3 cm)打開QQ軟件截圖功能，對(duì)所拍攝的照片進(jìn)行RGB讀數(shù)，為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，將顯色的濾紙平均分成四份。在四個(gè)區(qū)域分別讀數(shù)，取平均值。將得到的數(shù)據(jù)輸入EXCEL軟件中，按照數(shù)學(xué)模型計(jì)算[14]。

2.3.3 紙基微流控芯片法測(cè)定綠原酸含量的條件優(yōu)化

對(duì)于所制作的紙基微流控芯片進(jìn)行以下測(cè)定條件的優(yōu)化。

2.3.3.1 氯化鐵溶液體積的影響

分別準(zhǔn)確吸取0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL4%三氯化鐵溶液滴于紙芯片的親水檢測(cè)區(qū)，以濾紙為背景進(jìn)行拍照及取色。

2.3.3.2 氯化鐵溶液濃度的影響

分別吸取2 μL 2%、3%、4%、5%、6%的氯化鐵溶液在濾紙親水檢測(cè)區(qū)，待其干后，在檢測(cè)區(qū)上滴加40 mg/mL的綠原酸2.0 μL，同時(shí)吸取對(duì)應(yīng)氯化鐵溶液于濾紙親水檢測(cè)區(qū)，作為空白對(duì)照。以濾紙為背景進(jìn)行拍照及取色。

2.3.3.3 綠原酸溶液點(diǎn)樣體積的影響

分別吸取2.0 μL4%氯化鐵溶液滴于紙芯片的每個(gè)親水檢測(cè)區(qū)，待其干(約30 s)后，于檢測(cè)區(qū)依次準(zhǔn)確滴加0、0.5、1、1.5、2.0、2.5 μL的40 mg/mL的綠原酸溶液，于室溫下反應(yīng)5 min后，進(jìn)行拍照及取色。

2.3.3.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

制作5個(gè)1×3的紙基微流控芯片，在膠帶上粘貼6 mm圓3個(gè)，在其中的一個(gè)圓上用記號(hào)筆標(biāo)注序號(hào)1。在余下兩個(gè)圓濾紙上使用0～2.5 μL的移液槍，分別吸取4%氯化鐵試劑2 μL，待其干后。一個(gè)圓上滴加40 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 μL，另外一個(gè)不滴加任何試劑。將制作好的試紙粘貼在玻璃板上，分別在常溫下反應(yīng)5、10、30、50、70 min后，以濾紙為背景進(jìn)行拍照及取色[15]。

2.3.4 紙芯片法測(cè)定綠原酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

在長(zhǎng)約15 cm的膠帶上每間隔0.5 cm粘貼直徑為6 mm的圓形濾紙一個(gè)，制備得到8×2的陣列檢測(cè)紙芯片。在最佳反應(yīng)時(shí)間、顯色劑用量下，滴加配置好的不同濃度的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行拍照及取色，分析其RGB值，代入建立的數(shù)學(xué)模型中，得到綠原酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.5 金銀花中綠原酸的含量測(cè)定

2.3.5.1 綠原酸提取液的制備

取10 g干金銀花放入粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)40目篩，提取，超聲過(guò)濾后將濾液定容至50 mL容量瓶。即得到綠原酸粗提[16]。

2.3.5.2 HPLC法-標(biāo)準(zhǔn)曲線法

色譜條件：色譜柱：Hypersil gold C18 (4.6 mm × 250 mm，5μm)，流動(dòng)相：乙腈∶0.4%磷酸水溶液(85∶15)；檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃。精密量取2、4、6、8 mL 0.1 mg/mL綠原酸對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋至10 mL，搖勻后得到不同濃度的綠原酸對(duì)照品溶液。各選10 μL進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。取提取的金銀花中綠原酸粗提液1 mL于100 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容。在相同色譜條件下，取10 μL進(jìn)樣，將測(cè)得的吸收峰面積代入回歸方程計(jì)算其濃度，并計(jì)算金銀花中綠原酸的質(zhì)量百分比。

2.3.5.3 紙芯片法-標(biāo)準(zhǔn)加入法

制備3×9陣列紙基微流控芯片[18]，在各親水檢測(cè)區(qū)按順序標(biāo)注序號(hào)1-9。在1-9檢測(cè)區(qū)分別滴加2 μL4%的三氯化鐵溶液，在1-7號(hào)檢測(cè)區(qū)滴加上述制備的10、20、30、40、50 mg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液2 μL。在8號(hào)檢測(cè)區(qū)滴加金銀花的綠原酸粗提液2 μL，9號(hào)檢測(cè)區(qū)作為空白對(duì)照，以濾紙為背景進(jìn)行拍照及取色，平行實(shí)驗(yàn)3次。取3次實(shí)驗(yàn)的RGB平均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算綠原酸含量。

2.3.5.4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取待測(cè)樣品提取液1 mL至燒杯中，備用，在制作的3×9的紙基微流控芯片上滴加4%的三氯化鐵2 μL，再分別準(zhǔn)確加入 0.1～0.5 μL的 40 mg/mL的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照已優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行顯色拍照及取色，平行三次實(shí)驗(yàn)。

2.3.6 數(shù)據(jù)處理

按照回收率=(加標(biāo)測(cè)定值-測(cè)定值)/加標(biāo)量，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)方法的回收率[19]。

3 結(jié)果與分析

3.1 顯色條件的優(yōu)化

3.1.1 氯化鐵體積的影響

不同氯化鐵體積對(duì)綠原酸檢測(cè)體系顯色的圖片及RGB值如圖2所示。在濾紙上可以看出，滴加0.5～1 μL時(shí)。黃顏色的三氯化鐵沒有完全覆蓋濾紙，在1.5 μL時(shí)剛好覆蓋，2、2.5 μL時(shí)完全覆蓋，為了保證氯化鐵在覆蓋濾紙且微過(guò)量。故選擇三氯化鐵溶液的滴加體積為2 μL。

圖2 氯化鐵體積的影響

3.1.2 氯化鐵濃度的影響

不同氯化鐵濃度對(duì)綠原酸檢測(cè)體系顯色的RGB值的影響如圖3所示。可知，隨著FeCl3的濃度增加，RGB值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)氯化鐵溶液濃度從4%開始R、G、B值趨于穩(wěn)定。由于氯化鐵溶液本身有顏色，過(guò)多的Fe3+存在RGB值減小，使靈敏度降低。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇4%的氯化鐵溶液作為最佳反應(yīng)濃度。

圖3 氯化鐵濃度的影響

3.1.3 綠原酸點(diǎn)樣體積的影響

不同綠原酸點(diǎn)樣體積下綠原酸檢測(cè)體系顯色的圖片及RGB值如圖4所示。從顯色圖上看，點(diǎn)樣體積為1.5 μL時(shí)，剛好鋪滿整個(gè)檢測(cè)區(qū)；從RGB值來(lái)看，點(diǎn)樣體積為2 μL時(shí)，RGB值趨于穩(wěn)定；點(diǎn)樣體積大于2 μL時(shí)RGB值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，這是由于邊界顯色物質(zhì)聚集使斑點(diǎn)顯色不均勻，造成R、G、B值重現(xiàn)性下降。綜合考慮，選擇點(diǎn)樣體積為2 μL。

圖4 綠原酸點(diǎn)樣體積的影響

3.1.4 反應(yīng)時(shí)間的影響

在常溫下不同反應(yīng)時(shí)間顯色圖片的RGB值如圖5所示。可以看出，該紙芯片反應(yīng)4 min后R、G、B值趨于穩(wěn)定，且在顯色10 min內(nèi)其RGB保持穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)選擇顯色時(shí)間為5 min。

圖5 反應(yīng)時(shí)間的影響

3.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

表1 不同數(shù)學(xué)模型的擬合情況

3.2 金銀花中綠原酸含量的測(cè)定

3.2.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按2.3.5操作，分別采用HPLC法測(cè)定綠原酸含量，平行3次，并與紙芯片法平行測(cè)定3次的結(jié)果進(jìn)行比較，如表2所示HPLC法和紙芯片法。可知，HPLC法和紙芯片法重復(fù)性較好，RSD均不超過(guò)3%。此外從綠原酸含量的平均值來(lái)看，兩種測(cè)定方法的結(jié)果較接近，說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果完全能夠滿足綠原酸的檢測(cè)，且檢測(cè)結(jié)果較為準(zhǔn)確、滿意。

表2 HPLC法和紙芯片法測(cè)定綠原酸含量的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.2 金銀花的加標(biāo)與回收

表3 金銀花的加標(biāo)回收

3.3 HPLC法與紙芯片法的比較

本文對(duì)HPLC法和紙芯片進(jìn)行了比較，結(jié)果如表4所示。可知，HPLC法具有檢測(cè)限更低、檢測(cè)儀器較昂貴的特點(diǎn)，而紙芯片法線性范圍更廣、檢測(cè)試劑體積極少、除智能手機(jī)外檢測(cè)材料可自制、成本更低廉，因此在一些檢測(cè)條件相對(duì)簡(jiǎn)陋的快速測(cè)定中，紙基微流控?cái)?shù)碼成像法更具優(yōu)勢(shì)。

表4 HPLC法與紙芯片法的比較

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)探究確定了三氯化鐵與綠原酸反應(yīng)的最優(yōu)條件，研究得到了檢測(cè)綠原酸的新方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在4%的氯化鐵試劑與綠原酸在常溫下就能發(fā)生反應(yīng)，并且在5 min之內(nèi)顏色完成顯色反應(yīng)，生成穩(wěn)定的深綠色化合物，并且試紙顏色不會(huì)褪色[20]。之后用手機(jī)拍照后，對(duì)照片進(jìn)行RGB值分析，通過(guò)建立的數(shù)學(xué)模型，即可得出待測(cè)液中綠原酸的濃度，且與HPLC法所測(cè)得的濃度相近。通過(guò)對(duì)金銀花中提取的綠原酸進(jìn)行測(cè)定并與HPLC法測(cè)定結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，紙基微流控芯片的測(cè)定結(jié)果與HPLC法測(cè)定結(jié)果基本一致，能夠?qū)崿F(xiàn)全定量測(cè)定綠原酸的濃度。綜上所述，所建立的紙基微流控?cái)?shù)碼成像法快捷、價(jià)格低廉，檢測(cè)要求低，可廣泛應(yīng)用于各種樣品綠原酸含量的快速測(cè)定。