基于MIRA技術(shù)的霍亂弧菌膠體金試紙條快速檢測(cè)方法的建立

李盛杰 江海濤 吳雨龍

摘要：為了建立一種快速、靈敏、便捷的針對(duì)霍亂弧菌的檢測(cè)方法，利用多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)不同引物組在膠體金試紙條檢測(cè)中的特異性和靈敏度進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明，在以質(zhì)粒為模板的特異性試驗(yàn)中，Probe1+引物對(duì)2、Probe1+引物對(duì)3、Probe2+引物對(duì)5這3組引物組均顯示出較高的特異性。但在靈敏度試驗(yàn)中，僅有Probe2+引物對(duì)5能夠檢出濃度為0.1 fg/μL的質(zhì)粒模板。在后續(xù)以核酸為模板的特異性和靈敏度試驗(yàn)中，Probe2+引物對(duì)5的引物組合同樣顯示出較強(qiáng)的特異性，并對(duì)核酸模板的檢出限可達(dá)到10 fg/μL，均顯示出優(yōu)于另外2種組合的特異性和靈敏度。本研究所建立的基于MIRA技術(shù)的霍亂弧菌檢測(cè)方法具有較高的特異性和靈敏度，對(duì)于推進(jìn)霍亂弧菌及其他致病菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)具有重要意義。

關(guān)鍵詞：霍亂弧菌;多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù);膠體金試紙

中圖分類號(hào)：S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）24-0167-05

收稿日期：2021-09-27

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2019YFC1605800）;江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（編號(hào)：20KJA416003）;江蘇省高校重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：蘇教科[2016]8）。

作者簡(jiǎn)介：李盛杰（1988—），男，江蘇徐州人，博士，講師，從事特殊生物質(zhì)資源利用研究。E-mail：lishengjie@njxzc.edu.cn。

通信作者：吳雨龍，博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事動(dòng)物生理生化相關(guān)研究。E-mail：wuyl_8080@163.com。

霍亂弧菌（Vibrio cholera）是一種革蘭氏陰性菌，是霍亂的病原體。霍亂可作為散發(fā)性、流行性或地方病發(fā)生，以引起嚴(yán)重腹瀉和脫水而聞名，如果不及時(shí)治療，可在48 h內(nèi)導(dǎo)致死亡[1]。研究表明，霍亂弧菌可以通過人類宿主形成高度傳染性狀態(tài)，經(jīng)排泄到自然環(huán)境中，引發(fā)霍亂的流行[2]。霍亂弧菌廣泛存在水生動(dòng)物中或受污染的食物中，特別是貝類和甲殼類動(dòng)物[3]。因此，建立霍亂弧菌快速、高效的檢測(cè)手段，對(duì)于保障食品質(zhì)量安全，維護(hù)人民生命健康，加強(qiáng)公共衛(wèi)生防疫方面具有極其重要的意義。由于霍亂弧菌可以以2種形式存在：活的可培養(yǎng)的和活的但不可培養(yǎng)的（VBNC），使用傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行檢測(cè)具有一定的局限性[4]。目前，針對(duì)霍亂弧菌檢測(cè)的方法雖然很多，包括免疫檢測(cè)法、生化鑒定法、實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）等方法，但這些方法均無法同時(shí)解決操作煩瑣耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)效率與檢測(cè)靈敏度低、檢測(cè)目標(biāo)單一、快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等問題[5-10]。

MIRA（Multi-enzyme Isothermal Rapid Amplification，簡(jiǎn)稱MIRA）是一種近年來發(fā)展起來的多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。作為一種新型的等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，MIRA不需要復(fù)雜的熱循環(huán)儀，而是通過簡(jiǎn)單的水浴或加熱工具即可在37～42 ℃的恒定溫度條件下進(jìn)行反應(yīng)。整個(gè)反應(yīng)過程主要依賴于3種必需的酶：重組酶，促進(jìn)特異性引物與模板DNA 配對(duì);單鏈 DNA 結(jié)合蛋白，無需加熱即可形成單鏈DNA;DNA 聚合酶，負(fù)責(zé)擴(kuò)增和延伸[11]。一旦反應(yīng)開始，模板DNA的擴(kuò)增就會(huì)迅速進(jìn)行，并且在不到 20 min的時(shí)間內(nèi)達(dá)到可檢測(cè)的水平。通過設(shè)計(jì)帶有修飾基團(tuán)的引物與探針，配合膠體金試紙條，可以極大地實(shí)現(xiàn)便攜式的現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)技術(shù)。

霍亂毒素（CT）、毒素共調(diào)節(jié)菌毛（TCP）和外膜蛋白W（OmpW）是霍亂弧菌的3個(gè)主要毒力因子[12]。外膜蛋白W的ompW基因也是霍亂弧菌菌株鑒定中常用的特異性檢測(cè)基因。本研究主要針對(duì)該基因設(shè)計(jì)多個(gè)引物和探針組，并在多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增體系中通過膠體金試紙條對(duì)霍亂弧菌的特異性和靈敏度檢測(cè)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

霍亂弧菌ompW基因質(zhì)粒（參考GenBank：MF100045.1序列信息構(gòu)建）;Tiosbio超快速核酸釋放劑、DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒、HybriDetect試紙條均購自濰坊安普未來生物科技有限公司;霍亂弧菌、小腸耶爾森氏菌的核酸提取物購自濰坊安普未來生物科技有限公司;副溶血性弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌分離株、創(chuàng)傷弧菌、鮑氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、坂崎克羅諾菌均來自筆者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器

PCR擴(kuò)增儀，T100TM，Bio-rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2021年3—6月在南京曉莊學(xué)院實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。根據(jù)MIRA技術(shù)引物設(shè)計(jì)原則，建議擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在150～500 bp之間，下游引物的5′端需要標(biāo)記1個(gè)修飾基團(tuán)（如生物素，biotin）。結(jié)合霍亂弧菌ompW基因（GenBank：MF100045.1）序列信息，采用PrimerPremier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，委托廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成，具體序列見表1。

1.3.2 探針設(shè)計(jì) 根據(jù)MIRA技術(shù)探針設(shè)計(jì)原則（圖1），探針為位于上下游引物中間，長(zhǎng)度在46～52 nt之間，并與目的片段互補(bǔ)的序列;同時(shí)在5′端修飾1個(gè)抗原標(biāo)記（如羥基熒光素，F(xiàn)AM）;在距5′端約30 nt序列位置上標(biāo)記1個(gè)dSpacer（四氫呋喃，THF），作為大腸桿菌核酸外切酶（NFO）的識(shí)別位點(diǎn);THF距離3′末端約15 nt，并且在3′末端標(biāo)記1個(gè)修飾基團(tuán)（如胺基、磷酸基團(tuán)、C3-spacer）。結(jié)合7對(duì)引物信息，設(shè)計(jì)得到符合引物對(duì)1、2、3、4的探針Probe1（[6FAM]AACATTTGCCACCTACCTTTATGGTCCAAT[THF]CTACTTTGGTGAAGC[C3spacer]）和符合引物對(duì)4、5、6的探針Probe2（[6FAM]AGTAGCGATAAAGTGTTAAACACTCAAAGT[THF]AGTTGGCAGTTAATA[C3spacer]）。

1.3.3 膠體金試紙條試驗(yàn)反應(yīng)體系 膠體金試紙條試驗(yàn)反應(yīng)體系見表2。

1.3.4 膠體金試紙條試驗(yàn)操作步驟 在每個(gè)反應(yīng)管中加入適量的Buffer A、上下游引物、探針（探針引物濃度均為10 μmol/L）、ddH2O、核酸模板、BufferB，并充分混合，短暫離心后立即將反應(yīng)管放入恒溫設(shè)備中37 ℃孵育8～12 min;反應(yīng)結(jié)束后，取10 μL反應(yīng)液加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中3～5 min，觀察質(zhì)控線與檢測(cè)線判讀結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒模板試紙條特異性

選擇7組引物和對(duì)應(yīng)的探針，將霍亂弧菌ompW基因質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行膠體金試紙條特異性反應(yīng)的初篩。膠體金試紙條初篩結(jié)果顯示，每組檢測(cè)線均出現(xiàn)了條帶，說明不同的引物探針組均能檢出質(zhì)粒濃度10 fg/μL以上的目標(biāo)分子，其中2、3、5組條帶最為明顯（圖2）。因此，選擇這3對(duì)引物及對(duì)應(yīng)探針進(jìn)行后續(xù)膠體金試紙條的靈敏度試驗(yàn)。

2.2 質(zhì)粒模板試紙條靈敏度

選擇引物對(duì)2和探針Probe1的組合，將質(zhì)粒模板稀釋為10.00、1.00、0.10、0.01 fg/μL 4個(gè)梯度濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，第2組檢測(cè)線有微弱條帶出現(xiàn)，表明該探針引物組合可以檢出濃度為1 fg/μL的質(zhì)粒模板（圖3）。

選擇引物對(duì)3和探針Probe1的組合，將質(zhì)粒模板稀釋為相同的4個(gè)梯度濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第2組檢測(cè)線同樣可以看到微弱條帶，也可檢出濃度為1 fg/μL的質(zhì)粒模板（圖4）。

選擇引物對(duì)5和探針Probe2的組合，利用同樣稀釋后的質(zhì)粒模板進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第3組檢測(cè)線可以看到微弱條帶，表明其可以檢出濃度為 0.1 fg/μL 的質(zhì)粒模板（圖5）。

2.3 核酸模板試紙條靈敏度

為進(jìn)一步驗(yàn)證該方法在真實(shí)檢測(cè)環(huán)境中的效率，選擇從霍亂弧菌中提取的核酸作為模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)。選擇引物對(duì)2和探針Probe1的組合，設(shè)置1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL 3個(gè)梯度核酸模板濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，第1、2組檢測(cè)線有明顯條帶出現(xiàn)，表明該探針引物組合可以檢出濃度為100 fg/μL的核酸模板（圖6）。

選擇引物對(duì)3和探針Probe1的組合，將核酸模板稀釋為相同的3個(gè)梯度濃度進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第1組、第2組檢測(cè)線有明顯條帶出現(xiàn)，在第3組檢測(cè)線可以看到微弱條帶，表明可以檢出濃度為 10 fg/μL 的核酸模板（圖7）。

選擇引物對(duì)5和探針Probe2的組合，利用同樣稀釋后的核酸模板進(jìn)行膠體金試紙條的靈敏度檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，該探針引物組合在第1組、第2組、第3組檢測(cè)線均可以看到明顯條帶，表明其可以檢出濃度為10 fg/μL的核酸模板（圖8）。

根據(jù)以上試驗(yàn)結(jié)果，無論是在ompW基因質(zhì)粒模板的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)中還是在霍亂弧菌核酸模板的靈敏度檢測(cè)試驗(yàn)中，引物對(duì)5+Probe2的組合均表現(xiàn)出最優(yōu)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果。因此，選擇該探針引物組合進(jìn)行不同物種間的特異性檢測(cè)試驗(yàn)。

2.4 不同致病菌核酸模板試紙條特異性試驗(yàn)結(jié)果

在不同致病菌核酸模板的特異性檢測(cè)試驗(yàn)中，本研究選擇了4種其他弧菌（副溶血性弧菌、擬態(tài)弧菌、河弧菌、創(chuàng)傷弧菌）和6種可致消化系統(tǒng)疾病的常見細(xì)菌（鮑氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌、小腸耶爾森氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、坂崎克羅諾菌）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，引物對(duì)5+Probe2的組合對(duì)于其他致病菌核酸模板的檢出結(jié)果均為陰性，只有對(duì)霍亂弧菌核酸的檢出結(jié)果為陽性，說明該探針引物組合可以特異性地檢出霍亂弧菌而不檢出其他微生物（圖9）。

3 討論與結(jié)論

通過對(duì)全部7對(duì)引物探針組進(jìn)行初篩，顯示引物對(duì)2+Probe1、引物對(duì)3+Probe1和引物對(duì)5+Probe2的組合在試紙條檢測(cè)線均出現(xiàn)顯著明亮的條帶。在后續(xù)通過質(zhì)粒模板和核酸模板進(jìn)行靈敏度檢測(cè)的過程中，引物對(duì)5+Probe2的組合均表現(xiàn)出最優(yōu)的靈敏度，檢出限分別可達(dá)到0.1 fg/μL和 10 fg/μL。在不同致病菌核酸模板的特異性檢測(cè)試驗(yàn)中，引物對(duì)5+Probe2的組合同樣表現(xiàn)出良好的特異性，在所有11種檢測(cè)對(duì)象中，僅能檢測(cè)出霍亂弧菌而不檢出其他微生物。綜上判斷，我們認(rèn)為引物對(duì)5+Probe2的探針引物組通過膠體金試紙條在多酶恒溫核酸快速擴(kuò)增條件下，能夠特異性好和靈敏度高地完成霍亂弧菌的快速檢測(cè)。本試驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法，無需依賴細(xì)菌培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)分群等周期長(zhǎng)、操作繁瑣的手段，比常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)有更短的反應(yīng)時(shí)間，比環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增方法具有更低的反應(yīng)溫度，適用于食品安全檢測(cè)、病原體臨床診斷等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

本研究建立了一種基于MIRA技術(shù)的霍亂弧菌膠體金試紙條快速檢測(cè)方法，試驗(yàn)結(jié)果表明，引物對(duì)5+Probe2的探針引物組具備準(zhǔn)確可靠、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。該探針引物組可以通過后期開發(fā)成便攜且操作簡(jiǎn)單便利的一體化檢測(cè)試劑盒，用于實(shí)際生產(chǎn)和監(jiān)測(cè)環(huán)節(jié)中對(duì)霍亂弧菌的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Qadri F，Khan A I，F(xiàn)aruque A S G，et al. Enterotoxigenic Escherichia coli and Vibrio cholerae diarrhea，Bangladesh，2004[J]. Emerging Infectious Diseases，2005，11（7）：1104-1107.

[2]Peterson K M，Gellings P S.Multiple intraintestinal signals coordinate the regulation of Vibrio cholerae virulence determinants[J]. Pathogens and Disease，2018，76（1）：126-147.

[3]Bhandari M，Jennison A V，Rathnayake I U，et al. Evolution，distribution and genetics of atypical Vibrio cholerae-A review[J]. Infection，Genetics and Evolution，2021，89：104726.

[4]Conner J G，Teschler J K，Jones C J，et al. Staying alive：Vibrio cholerae’s cycle of environmental survival，transmission，and dissemination[J]. Microbiology Spectrum，2016，4（2）：1-32.

[5]韓 輝，畢玉國(guó)，祁 軍，等. 霍亂弧菌和擬態(tài)弧菌雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2015，38（3）：153-156.

[6]郭 容，董曉妹，別闖南，等. 五種重要致病性弧菌高通量液相芯片檢測(cè)方法的建立[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2021，51（7）：805-813.

[7]周霞霞，邱晶磊，楊 廣，等. 傳統(tǒng)培養(yǎng)法與熒光PCR法檢測(cè)弧菌的方法評(píng)價(jià)[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2021，12（4）：1550-1556.

[8]萬 瑩，陳永軍，任亞玲，等. 霍亂弧菌三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2019，49（9）：1143-1151.

[9]母潤(rùn)紅，聶丹丹，李明成，等. 水產(chǎn)品中食源性病原菌多重PCR快速檢測(cè)方法的建立[J]. 北華大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2020，21（6）：756-760.

[10]魏 霜，馬新華，汪天杰，等. 雙重DPO-PCR檢測(cè)副溶血弧菌和霍亂弧菌[J]. 食品工業(yè)科技，2016，37（22）：80-83.

[11]Tu F，Yang X T，Xu S K，et al. Development of a fluorescent probe-based real-time reverse transcription recombinase-aided amplification assay for the rapid detection of classical swine fever virus[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2021，68（4）：2017-2027.

[12]Taheri F，Nazarian S，Ahmadi T S，et al. Protective effects of egg yolk immunoglobulins （IgYs） developed against recombinant immunogens CtxB，OmpW and TcpA on infant mice infected with Vibrio cholerae[J]. International Immunopharmacology，2020，89：107054.