低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹耐寒性生理生化的影響

張續周 李金秋 陳雪津 王雯 李芳 馬媛春 房婉萍 朱旭君

摘要：綠葉揮發物（GLVs）作為植物揮發物中的一類化合物，由C18和C16不飽和脂肪酸經酶催化分解形成的C6和C9醛、醇及其相應酯類組成。其中，乙酸葉醇酯是一種主要的GLVs，以Z-3-己烯醛和Z-3-己烯醇經酶作用合成。為了解乙酸葉醇酯在茶樹耐寒性狀中的作用，以一年生茶樹品種中茶108為材料，使用乙酸葉醇酯后短時低溫（4 ℃，1.5 h）和低溫過夜（4 ℃，16 h）處理茶苗，測定茶樹冷誘導基因表達和茶樹生理生化特性指標。結果發現，乙酸葉醇酯在短時低溫處理時可以提高冷誘導基因CsICE1、CsICE2、CsCBF1-CsCBF5的表達;在過夜低溫處理時提高冷誘導基因CsRD1、CsRD2的表達;短時低溫和過夜低溫處理均能分別顯著提高茶樹過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的酶活性，從而緩解低溫脅迫對茶樹的傷害。此外，乙酸葉醇酯還誘導自身合成途徑關鍵酶基因CsADH1、CsADH3和CsLOX3的表達，進一步增強茶樹耐寒能力。

關鍵詞：茶樹;綠葉揮發物;乙酸葉醇酯;低溫脅迫;耐寒性

中圖分類號：S571.101 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0127-06

收稿日期：2021-08-23

基金項目：國家自然科學基金（編號：31800588）;青島農業大學科研啟動基金（編號：1118025）;山東省良種工程子課題（編號：2321401）;青島職業技術學院重點研發專項（編號：2020ZDYF09）;北茶技藝技能傳承創新平臺資助。

作者簡介：張續周（1972—），男，山東菏澤人，碩士，副教授，主要從事茶樹育種與生物技術研究。E-mail：jiaonancha@126.com。

通信作者：朱旭君，博士，副教授，研究方向為茶樹育種與栽培。E-mail：zhuxujun@njau.edu.cn。

低溫是茶樹生長發育中遭受的主要非生物脅迫之一，限制了茶樹的生長發育[1]。低溫會影響細胞膜流動性，破壞細胞骨架，影響自由基產生和清除系統的平衡以及引起酶活性的改變等[2-4]。此外，低溫還會引起茶樹中兒茶素、維生素和氨基酸等品質成分的變化[5]。茶樹受到低溫脅迫時，會發生一系列反應以提高自身對低溫的抵抗能力，這種現象稱為冷馴化[5]。冷馴化過程涉及大量的生理生化變化，其中包括冷誘導基因的表達，調節滲透物質的生成和抗氧化酶系統的作用等途徑。

某些冷誘導基因在低溫脅迫中的作用已經明確[6-8]，如ICE（inducer of CBF expression）在收到冷脅迫信號后，與CBF（C-repeat binding factor）啟動子結合誘導CBF基因表達[9]，CBF識別CRT/DRE順式作用元件調控下游COR（cold regulate）基因的轉錄，編碼親水性多肽增強細胞脂膜穩定性從而提高植物抗寒性[10]。其中，COR基因是一類在低溫下可以快速表達的植物抗寒基因，也可以稱為LTI（low temperature induced）、KIN（cold induced）、RD（response to dehydration）、ERD（early dehydration induced）基因[11]。

綠葉揮發物（green leaf volatiles，簡稱GLVs）是植物揮發物中的一類化合物，包括C16和C18不飽和酶和異構酶等作用下生成相應的醇和酯類[12-13]。脂氧合酶（lipoxygenase，簡稱LOX）和氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide yase，簡稱HPL）作為脂氫過氧化物裂解酶催化形成C6和C9醛，進一步通過脂質代謝途徑合成GLVs[12-15]。同時，GLVs含量也對合成酶具有反饋調節作用，如外源施用順-3-己烯醇能在24 h內顯著誘導茶樹LOX和ADH基因的表達[16]。GLVs在植物遭受機械損傷，草食性昆蟲蟲害，病原菌感染[15]時發揮防御作用;干旱、高溫、低溫[13]、強光和重金屬等非生物脅迫[17-19]也會促進GLVs的釋放。此外，外源施用生長素和赤霉素也會誘導甜瓜CmLOX09基因的表達[20]。外源Z-3-己烯醇可以通過反向調節自身合成關鍵酶基因LOXs、ADHs的表達，誘導DREB-2A和RDs基因表達并通過提高抗氧化酶活性等途徑提高茶樹對干旱脅迫的抗性[18]。乙酸葉醇酯是一種主要的綠葉揮發物，Z-3-己烯醛和Z-3-己烯醇（Z-3-HAC）經乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，簡稱ADH）和酰基轉移酶（acyltransferase，AAT）作用最終生成乙酸葉醇酯，乙酸葉醇酯在茶樹中的作用研究還未曾見。

本研究通過外源使用乙酸葉醇酯，測定低溫處理后茶苗相關的生理特性指標和冷誘導基因表達情況，初步明確了乙酸葉醇酯在茶樹抗寒性中的作用，為進一步深入研究乙酸葉醇酯在茶樹低溫脅迫中的作用機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料茶樹品種中茶108為一年生扦插茶苗，購于南京雅潤茶業有限公司。于2019年在南京農業大學茶學實驗室進行試驗處理。茶苗處理前在人工氣候箱中培養2個星期，培養條件為光照 16 h（25 ℃）/黑暗8 h（20 ℃），光照度3 600 lx，相對濕度60%～70%。

1.2 試驗方法

T1（短時低溫處理）：乙酸葉醇酯（溶劑為二氯甲烷）處理1.5 h，4 ℃低溫處理1.5 h;CK1（短時低溫對照）：二氯甲烷處理1.5 h，室溫放置3 h，4 ℃低溫處理1.5 h。T2（低溫過夜處理）：乙酸葉醇酯（溶劑為二氯甲烷）處理1.5 h，室溫放置0.5 h，4 ℃低溫處理16 h;CK2（低溫過夜對照）：二氯甲烷處理1.5 h，室溫放置0.5 h，4 ℃低溫處理16 h。取第1、2葉放入液氮速凍，-80 ℃保存。

1.3 測定指標及方法

參照酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量;采用超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、過氧化物酶（POD）試劑盒和過氧化氫酶（CAT）試劑盒測定相應酶活性，試劑盒均購于南京建成生物工程研究所有限公司;高效液相色譜法GB/T 8313—2008測定茶葉中兒茶素各組分含量。

葉片總RNA使用艾德萊 RN5301 EASYspin Plus 多糖多酚/復雜植物RNA快速提取試劑盒提取。RNA 反轉錄使用PrimeScriptTM RT Reagent Kit with gDNA Eraser（日本 TaKaRa 生物公司）試劑盒進行。利用qRT-PCR反應測定茶樹GLVs合成相關基因CsADH和CsLOX，以及抗寒相關基因CsICE、CsCBF和CsRD的相對表達量。基于茶樹基因組數據庫（http：//tpia.teaplant.org/index.html）獲得茶樹相關基因序列，利用Primer5設計特異性引物（表1）。qRT-PCR反應試驗使用SYBR Green PCR master mix試劑盒（日本TaKaRa生物公司），儀器使用Bio-Rad IQ5實時熒光定量儀（Bio-Rad，USA），內參基因為β-actin。定量反應程序為95 ℃預變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環[21]。每個處理試驗重復3次，基因相對表達量分析采用2ΔΔCT法計算。

1.4 數據分析

試驗數據使用Excel 2010和SPSS Statistic 20.0軟件對數據進行分析，方差分析多重比較采用Duncan’s新復極差法，P<0.05表示差異顯著。采用Graphpad Prism 5作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹GLVs合成相關基因表達的影響

茶樹中GLVs主要來源于亞麻酸降解途徑，該途徑中的關鍵酶為LOX、HPL和ADH。外源Z-3-己烯醇能在24 h內顯著誘導茶樹LOXs、ADHs部分基因積累，對HPL無明顯效果[18]。為了解低溫環境下外源施用乙酸葉醇酯對GLVs合成途徑關鍵酶基因的影響，測定CsADH1、CsADH2、CsADH3和CsLOX1、CsLOX2、CsLOX3的表達情況，結果（圖1）表明，短時低溫（4 ℃，1.5 h）下外源乙酸葉醇酯顯著提高了CsLOX3積累量（P<0.05），顯著抑制了CsADH1、CsADH2、CsADH3的表達。 低溫過夜處理（4 ℃，16 h）中外源乙酸葉醇酯處理使CsADH1、CsADH3和CsLOX3表達量顯著增加，CsADH2和CsLOX1表達量顯著降低。

2.2 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹耐寒相關基因表達的影響

茶樹在低溫脅迫下，一些冷誘導基因表達會上調，CsICE和CsCBF是低溫信號傳遞中的重要元件，能夠感受上游信號并將低溫信號向下游傳遞[22-24]。為明確外源施用乙酸葉醇酯對低溫脅迫下冷誘導基因表達的影響，測定了CsICEs、CsCBFs和CsRDs部分基因的表達情況（圖2）。短時低溫處理（4 ℃，1.5 h）中外源乙酸葉醇酯顯著提高了CsICE1、CsICE2和CsCBF1～CsCBF5的表達量;CsRD1-CsRD3表達降低。 低溫過夜處理（4 ℃，16 h）中， 外源乙酸葉醇酯處理使CsICE1、CsRD1 和CsRD2積累增加，顯著降低了CsCBF1～CsCBF5和 CsRD2的表達量，對CsICE2無顯著影響。

2.3 低溫脅迫下乙酸葉醇酯對茶樹生理指標的影響

2.3.1 茶樹保護酶活性 茶樹在受到低溫脅迫時

產生大量活性氧會使膜脂發生脂質過氧化反應，為保護細胞免受傷害，抗氧化酶系統被激活。通過測定茶樹抗氧化酶系統中重要的氧化酶SOD、POD和CAT活性，發現外源乙酸葉醇酯使POD活性在短時低溫（T1）和低溫過夜處理（T2）時均增加;SOD和CAT活性在施用乙酸葉醇酯后低溫過夜處理時表達量增加，但在未施用乙酸葉醇酯的短時低溫處理中表達量更高（圖3）。

2.3.2 茶樹游離脯氨酸含量 脯氨酸是植物細胞抗寒的主要滲透調節物質之一，在低溫脅迫下，游離脯氨酸含量會增加，以增加細胞液濃度，增強細胞保水能力，從而增強細胞耐寒性[2]。外源乙酸葉醇酯使短時低溫（T1）和過夜低溫處理（T2）中茶樹葉片游離脯氨酸含量均降低，分別降低了16.76%和69.68%（圖4）。

2.3.3 茶樹葉片中兒茶素和咖啡堿含量 低溫脅迫會影響茶樹葉片中理化成分的合成，進而影響茶葉的品質，本試驗測定了茶葉中主要兒茶素單體成分和咖啡堿含量（圖5），施用外源乙酸葉醇酯，茶樹葉片中GC的含量在低溫過夜處理（T2）相對更高，茶樹葉片中ECG和CG在短時低溫處理時（T1）含量均增加。外源乙酸葉醇酯處理在茶樹短時和過夜低溫處理時，咖啡堿含量均明顯減少。

3 討論與結論

植物正常生長情況下體內只存在極少量的綠葉揮發物，在受到機械損傷、低溫、干旱和蟲害等外界脅迫時，能迅速釋放大量綠葉揮發物來抵抗外界脅迫[25]。本試驗在低溫脅迫前使用乙酸葉醇酯進行處理，通過研究短時低溫處理和過夜低溫處理中茶樹葉片LOXs、ADHs部分基因和冷脅迫誘導基因ICEs、CBFs和CORs家族部分成員的表達情況，發現乙酸葉醇酯能在短時低溫處理時顯著誘導CsLOX3的表達;過夜低溫處理時CsADH1和CsADH3的相對表達量也增加。GLVs可以通過反向調節自身合成途徑關鍵酶基因的表達，促進綠葉揮發物和茉莉酸等激素的合成，進一步增強茶樹抗性[16]。乙酸葉醇酯使短時低溫處理時CsICE1、CsICE2、CsCBF1、CsCBF5基因的表達被誘導;低溫過夜處理時，CsRD1和CsRD2基因的表達量增加，而CsCBF1～CsCBF5基因的表達量降低。這可能與CBF基因和RD基因響應冷脅迫順序有關，CBF在低溫信號轉導過程中位于上游環節，響應冷脅迫迅速;RD基因在下游環節，響應冷脅迫時間較長[26-27]。CBF基因轉錄產物在低溫脅迫下15 min后迅速積累，2 h含量達到最高水平后逐漸下降，而COR（RD）基因轉錄產物才開始積累[10]。

SOD、POD和CAT是細胞抗氧化酶的重要組成部分，能夠在植物受到非生物脅迫時清除細胞內的自由氧，維持植物體內的活性氧代謝平衡，緩解自由氧對細胞的傷害[28]。本試驗中外源乙酸葉醇酯的施用顯著提高了低溫過夜處理下茶樹葉片SOD、POD和CAT的酶活性。此外，外源乙酸葉醇酯的施用還會影響茶樹葉片的理化成分，增加了低溫脅迫下茶樹體內GC、ECG和CG的含量，降低了咖啡堿含量。

本試驗結果表明，乙酸葉醇酯在短時低溫（4 ℃，1.5 h）和低溫過夜處理（4 ℃，16 h）中可通過提高自身合成基因CsADH1、CsADH3和CsLOX3的表達量;促進冷誘導基因CsICE1、CsICE2、CsCBF1～CsCBF5、CsRD1和CsRD2按冷信號傳導順序表達;增強SOD、POD和CAT酶活性等方式提高茶樹的抗寒性。

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