蕓薹屬種內與種間雜種遺傳學特征

朱永生 李漢仁 陳紀鵬

摘要：蕓薹屬包括多種蔬菜和油料作物，是與人類生產、生活關系最密切的一個屬。為了研究白菜型油菜與其近緣種間的雜交親和性及雜種后代的遺傳特征，采用剝蕾去雄和人工授粉方法進行小白菜與甘藍型油菜種間雜交AACC×AcAc以及小白菜與黃芽白不同栽培種間雜交AcAc×AhAh，并分析雜種后代的表型、花粉育性和細胞學等遺傳特征。結果表明，AACC×AcAc雜交組合雜交授粉親和性差，在授粉后出現胚發育夭亡現象，以較低的比例獲得了雜種后代，雜種后代表現出生物產量高、生命力旺盛、生長勢較強等特點。雜交組合AcAc×AhAh獲得雜種后代的比例較高，雜種后代植株較矮小。AACC×AcAc雜種后代花粉母細胞減數分裂過程中有單價體、不均等分離等異?，F象出現，與之相應其花粉育性和結實率也較差。AcAc×AhAh雜種后代花粉母細胞減數分裂過程中染色體聯會正常，所有染色體都形成二價體，后期I染色體也是均等分離，因此花粉育性好，結實率高。蕓薹屬雜種后代合成及其遺傳特征研究有助于蕓薹屬栽培植物遺傳資源拓展和新品種培育。

關鍵詞：白菜型油菜;甘藍型油菜;遠緣雜交;細胞遺傳

中圖分類號：S634.303 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）24-0085-05

收稿日期：2021-03-27

基金項目：國家自然科學基金（編號：31460357）;江西省自然科學基金（編號：20202BABL205017）;江西省教育廳科研項目（編號：GJJ170908）。

作者簡介：朱永生（2000—），男，江西新干人，主要從事植物遺傳育種研究。E-mail： 2991753843@qq.com。

通信作者：陳紀鵬，博士，副教授，主要從事油菜遠緣雜交和細胞遺傳研究。E-mail：chensi20020606@163.com。

隨著現代育技術的不斷發展，蕓薹屬植物中現有的遺傳資源卻越來越稀少，而遠緣雜交在近緣物種基因資源拓展、改良植物新品種和創造植物新類型方面具有重要作用[1-2]。蕓薹屬植物雜交后代常表現出較高的生物產量、旺盛的生長活力、生長勢強等雜種優勢，并可將近緣種的優良基因引入栽培種[3-5]。當前蕓薹屬栽培種由于不斷地進行人工選擇以及氣候環境的影響，導致其種內的遺傳多樣性顯著減少，而用于品種選育的親本資源也不斷下降。采用不同栽培種間雜交以及不同種間雜交甚至親緣關系更遠的雜交，合成蕓薹屬遠緣雜種，即為蕓薹屬栽培種，創造新的遺傳類型、轉入有利基因用于植物的遺傳改良、提高栽培種的品質及產量[6-9]。

蕓薹屬植物種類繁多，物種豐富廣泛，包含很多的亞種、變種和栽培種，是重要的蔬菜、油料和藥用植物。甘藍型油菜是重要的油料作物之一，起源于歐洲，培育年限較短，遺傳基礎較窄，但是它角果大、籽粒大、結籽數多。白菜型油菜栽培歷史悠久，遺傳資源非常豐富，具有耐貧瘠、耐旱、耐寒等特性，可根據這些物種之間的差異，來豐富我國油菜育種的遺傳基礎[10]。利用甘藍型油菜與白菜型油菜二者進行種間雜交和種內雜交豐富甘藍型油菜的遺傳資源是當前常用的育種方法[11，12]。本試驗采用人工去雄和輔助授粉的方式進行甘藍型油菜與小白菜雜交和小白菜與黃芽白之間雜交，并結合胚培養的方式獲得雜種后代，觀察雜種后代的遺傳學特征，創建蕓薹屬育種新材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采用甘藍型油菜湘油15（Brassica napus var. xiangyou15）與白菜型油菜栽培種小白菜（B. rapa var. chinensis）進行種間雜交獲取種間雜種后代AACC×AcAc。以小白菜和黃芽白（B. rapa var. huangyabai）做親本進行不同栽培種間雜交獲取種內雜種AcAc×AhAh。于2017年10月上旬在田間種植上述親本材料。由于白菜型油菜生育期較短，所以白菜型油菜適當晚播以使父母本花期相遇。

1.2 人工雜交

第2年春季油菜盛花期，采用人工去雄和輔助授粉的方法進行雜交。選擇晴朗天氣，對母本進行人工剝蕾去雄，并立即用牛皮紙袋套上，別好回形針，做好標記，同時對父本也用牛皮紙套好，以防止花粉被污染。第2天上午取前1 d套好袋且剛剛開放的父本花朵對前1 d去雄的母本進行授粉，授粉之后再用紙袋套好，做好標記。后期進行胚培養或收獲種子，以獲得雜種數與授粉花雜數之比作為親和指數，代表雜交親和性。

1.3 胚培養

授粉大約15 d左右（具體時間視雜種胚發育時期確定），從母本植株上取下授粉后膨大的角果進行胚培養。先用70%乙醇對角果表面消毒 2～3 min，然后浸入0.1%的氯化汞溶液中浸泡 15 min，從氯化汞溶液中取出后用無菌水漂洗3次，將角果表面殘留的有害藥劑洗凈。在超凈工作臺的無菌環境下，輕輕將角果剝開后，從胚珠中取出幼胚接種于MS培養基表面，置于20 ℃，光周期為 12 h/24 h 的環境下培養。待幼胚長出芽時，把芽轉接種在 MS+0.25 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA的培養基擴繁。最后將幼苗轉入MS培養基中生根培養，待幼芽的根長出較多后移栽到田間。

1.4 雜種后代花粉育性觀察

在雜種植株盛花期觀察雜種植株花粉育性。在天氣晴朗的上午取雜種植株剛開放的花藥，每株2枚放在載玻片上，滴醋酸洋紅染色液，再用攝子將花藥壓破使花粉粒散出，并去除花藥壁殘片。蓋上蓋玻片，輕輕按壓后置于顯微鏡下觀察。有活力的花粉粒在顯微鏡下是大而圓的，而且著色比較深，而不育的花粉則表現為小而癟，不容易被染色，顏色較淺，從而可以區分可育花粉和不育花粉。每個雜交組合選10株進行花粉育性觀察，每株觀察花粉至少100粒，統計可育花粉所占的比例。

1.5 雜種后代減數分裂細胞學觀察

為了觀察花粉母細胞減數分裂，在雜種植株初花期摘取其幼嫩花蕾，用卡諾固定液（無水乙醇與冰乙酸體積比為3 ∶1混合溶液）進行處理，處理時間≥24 h，處理完成后浸泡于75%乙醇中并貯藏于-20 ℃的冷凍箱中備用。觀察時取出備用的幼嫩花蕾放入盛有清水的培養皿中清洗殘留花蕾表面的乙醇，接著用鑷子從花蕾中取出1～2個花藥放于盛有1 mol/L HCl溶液的燒杯中，并在溫度為60 ℃水溫中水浴加熱水解2 min，然后取出花藥用清水漂洗去HCl，最后將處理完成的花藥放于蓋玻片上并用鑷子將花藥壓破使花粉母細胞散出，再用卡寶品紅進行染色，蓋上蓋玻片并壓片，放于高倍顯微鏡下觀察花粉母細胞減數分裂。將所觀察到的花粉母細胞減數分裂圖片拍照保存。

2 結果與分析

2.1 雜交親和性比較

通過人工去雄、輔助授粉和胚培養，在以小白菜為母本、黃芽白為父本的雜交組合（AcAc×AhAh）以較高的親和指數（1.91）獲得雜種后代植株。而以甘藍型油菜為母本、小白菜為父本的雜交組合（AACC×AcAc）親和指數只有0.29）。AcAc×AhAh組合通過人工授粉進行雜交，觀察雜交親和性，共調查225莢，在這些莢中空莢的數目有13個，占總數的 5.7%，有種子的莢中平均每莢結籽數目有1～5粒，占總數的8.7%籽粒不飽滿，不能正常發芽。AACC×AcAc組合授粉的花朵只有不到50%種子發育形成角果，其他的由于沒有繼續發育而凋落。發育的種子也有較多不飽滿不能正常發芽，雜交成功率較低（表1）。

授粉后15 d左右，取部分角果進行胚培養，培養5 d后幼胚開始成長出濃密的白色根毛，10 d左右就開始形成真葉，但多數幼苗生長畸形。生長 20～30 d時剪幼芽繼代培養便獲得生長旺盛的幼苗。移栽前30 d轉入不加任何激素的MS生根培養基，全部幼苗都能正常生根。AcAc×AhAh組合和AACC×AcAc組合分別以0.80和0.62的成功率獲得雜種植株（表2）。

2.2 雜種后代形態學特征

AACC×AcAc雜交后代植株的葉片形態和葉片大小接近甘藍型油菜，苗期葉裂比甘藍型油菜更深，葉的長度長于甘藍型油菜，葉的顏色與甘藍型油菜相似，在葉片表面還覆蓋了一層薄薄的蠟質（圖1-A、B）。雜種植株花呈黃色，形態與甘藍型油菜相似，開花較早，花期與親本相比較長。推測可能是由于雜種結實率低，在生長過程中生殖生長時間短從而消耗營養較少。雜種植株雌蕊外觀形態發育正常，但雄蕊發育不完全，花絲短，花藥中花粉含量少，可育花比例低（圖1-C）。成熟期雜種植株形態與甘藍型油菜相似，分枝較多，生長旺盛，表現出一定的雜種優勢;花期較長，田間自由授粉情況下能產生少量種子，每個角果5～10粒種子發育成熟。

AcAc×AhAh雜交組合中，雜種植株的葉片形態和大小與親本相似，有些雜種植株表面都覆蓋一層長毛，表面粗糙（圖2-A、圖2-B、圖2-C）。雜種植株株高接近雙親，第一分枝高度卻遠遠高于兩親本，一級分支數高于兩親本，每株角果數介于兩親本之間，大部分種子都能發育成熟（表3）。

2.3 花粉母細胞減數分裂

AACC×AcAc雜交后代雖然營養生長旺盛，在形態上表現出較強的雜種優勢，但花粉母細胞減數分裂過程中出現較多的染色體行為異常。如染色體聯會時出現單價體，后期有的細胞出現落后染色體或染色體橋（圖1-D）。因此，雜種后代花粉育性較低，而且自交結實率低。而AcAc×AhAh雜種后代花粉母細胞減數分裂各個階段染色體行為表現正常，花粉形成過程正常，花粉粒育性良好（圖2D）。從圖2-E可以看出，花粉母細胞處于減數第一次分裂后期，細胞的染色分別移向細胞的兩級，沒有出現染色體落后現象，染色均等分離，細胞的兩級均得到一個完整的染色體組。

3 結論與討論

隨著現代生物技術在遺傳育種中應用越來越廣泛，克服遠緣雜交中生殖隔離，并不斷獲得新品種，為蕓薹屬植物遺傳改良提供了豐富的資源基礎[13-15]。為了利用作物種間優良的遺傳資源，用小白菜與黃芽白、小白菜與甘藍型油菜進行雜交，并且通過人工去雄、輔助授粉和胚培養等輔助方法獲得了后代雜種。黃芽白和小白菜進行雜交，親和性好，結實正常，雜交種子沒有出現結籽異常的現象，表明小白菜型油菜種內不同栽培種之間雜交容易進行。而甘藍型油菜與小白菜之間雜交親和性較差。在眾多植物遠緣雜交中，兩親本的染色體數目的多少也會影響雜交的親和性[16]。母本選擇染色體數量多的雜交后代更容易獲得[17-18]。在本試驗中，小白菜與甘藍型油菜間雜交的組合中，選用染色體少的小白菜做母本，染色體數量多的甘藍型油菜做父本，授粉后20 d進行統計，出現了雜交結籽異常的情況，雜交不親和，結籽粒少，莢內發芽數多等情況，還有些胚乳出現嚴重敗壞的現象，胚死亡而沒有得到雜種種子。而在以甘藍型油菜為母本的反交組合中，兩親本的親和性表現較好。外界環境因素是影響油菜遠緣雜交親和性大小的因素之一[19]。外界環境因素也會對油菜雜交產生一定的影響，長日照高溫之所以會提高植物雜交親和力，主要是長日照高溫促進植物受精作用，使得植株受精過程中的生理生化反應得以改變[20]。隨著現代科學和生物科技的不斷發展，較好地克服了遠緣雜交的不親和性，并為油菜育種提供了另一方法與途徑。選用的雜交組合不一樣，雜交后代的親和性也不同[21]。雜交親本的選擇和外界環境因素共同作用影響雜交親和性，在棉花雜交中也出現類似情況[22]。

遠緣雜交不親合表現在有性繁殖過程的多個環節。花粉管生長遲緩且畸形，導致花粉無法到達胚珠而出現受精受阻的現象;還有一種原因可能是因為在人工雜交的過程中，花粉的黏合性比較差，花粉很難一直保持在柱頭上;受精后因為遠緣雜交的植株之間產生的不親和性，胚乳又表現出敗壞，最終出現胚死亡的現象?？偟膩碚f，一般情況下的人工雜交難以獲得成功，因此，胚培養是克服雜種幼胚夭亡最有效的方法，許多遠緣雜種通過人工雜交結合胚培養而獲得[22]。

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