含ZnO多孔生物玻璃骨修復支架的制備及體外性能研究*

王 薇 蘇 欣 王 珍 王建春 王宏遠

目前，國民生活水平普遍提升，口腔種植技術飛速發展，人們已將種植義齒當作牙齒缺失的首選修復方法，然而骨缺損卻嚴重限制了種植義齒的臨床應用。自體骨移植來源有限、移植過程會增加患者創傷且有時會誘導供區處健康組織的壞死；異體骨移植有傳播疾病的風險，且需進行免疫抑制藥物管理；因此，兼具生物活性和安全性的骨替代材料越來越受到廣大研究人員的關注［1］。生物玻璃（BG）具有良好的生物活性、生物相容性、能促進骨和軟組織的再生，并且，向BG中加入功能性金屬元素還可以提高其生物學功能［2-4］。ZnO能夠促進成骨細胞黏附、增殖，有助于骨組織的生長，并有一定的殺菌消毒功能［5］。相關研究表明，傳統鋁硅酸鹽玻璃中的鋁元素在骨修復移植領域中應用時呈現出一定的神經毒素特征，因此需要制備不含有氧化鋁或盡量減少氧化鋁含量的BG［6］。然而國內外關于ZnO全部或部分取代Al2O3對BG機械性能、生物活性及生物降解等方面的影響卻鮮有報道。本實驗以鋁硅酸鹽玻璃為基礎，用ZnO取代部分Al2O3，采用有機泡沫浸漬法，制備出一種含鋅多孔BG骨修復支架材料，并對其機械、生物性能進行測定及分析如下。

1.材料與方法

1.1 實驗材料及設備

實驗材料見表1

實驗設備見表2

表2 實驗設備

1.2 研究方法 本實驗主要研究不同含量ZnO取代Al2O3對多孔生物玻璃（BG）支架的孔隙率、抗壓強度（CS）、抗彎強度（BS）、降解性能及體外礦化活性的影響。

以鋁硅酸鹽玻璃（Al2O3-SiO2-CaO-P2O5-Na2O）為基礎，用不同含量（1、2、3wt%）的ZnO（六角晶系結晶體）取代鋁硅酸鹽玻璃中的Al2O3(見表3)，采用熔融法制備含ZnO 的基礎玻璃（Al2O3-SiO2-CaO-P2O5-Na2O-ZnO）。然后以聚氨酯海綿為模板（在300℃左右時會揮發而不留雜質），采用有機泡沫浸漬法，制備出含ZnO的多孔BG支架，分別為A組：不含ZnO的BG支架，B組：含1wt%ZnO的BG支架，C組：含2wt%ZnO的BG支架，D組：含3wt%ZnO的BG支架。

表3 含ZnO多孔BG支架質量百分比（wt%）

1.3 實驗過程

1.3.1 基礎玻璃的制備 基礎玻璃用熔融法制備：將原料研磨均勻后，放入高溫箱式電阻爐中燒結（1500℃、保溫2h)，水淬、烘干，制得基礎玻璃（見圖1）。

圖1 基礎玻璃試樣

1.3.2 多孔生物玻璃（BG）支架煅燒溫度的確定多孔BG支架的煅燒溫度應該在基礎玻璃的軟化溫度與析晶溫度之間，基礎玻璃的軟化溫度通過熱膨脹測試獲得，析晶溫度通過差熱分析獲得，升溫速率均為5℃/min，測試范圍從室溫到1200℃（見表4）。

表4 基礎玻璃溫度參數

1.3.3 多孔生物玻璃（BG）支架的制備 多孔BG 支架用有機泡沫浸漬法制備［7］。①將基礎玻璃破碎、研磨、過200 目篩和325 目篩，得到粒徑在0.045-0.074mm 之間的玻璃粉末。②聚氨酯海綿改性：用15wt%的NaOH溶液，在60℃的水浴鍋中，對40ppi（ppi：指每平方英寸的海綿質）的聚氨酯海綿進行改性處理，改性時間為40min（改性后的聚氨酯海綿更加蓬松、柔軟，更有利于掛漿），取出后用清水沖洗，室溫下晾干。③將改性后的聚氨酯海綿完全浸入配好的漿料（56wt%的基礎玻璃粉，1.8wt%的乙基纖維素—粘結劑，15wt%的聚乙二醇5ml—分散劑，20ml 的無水乙醇—溶劑）中，再擠出多余漿料，使少量漿料均勻粘附在海綿骨架上，然后在室溫下干燥24h，80℃干燥箱中干燥2h，將樣品放入高溫箱式電阻爐中進行燒結（經過在工作窗口溫度范圍內進行試燒，最終確定理想的燒結溫度制度，具體見表5），然后隨爐冷卻，制備出理想的多孔BG支架。

表5 多孔BG支架的成型溫度

1.3.4 多孔生物玻璃（BG）支架試件的制備 在本實驗中，需要制備三種尺寸的試件（見圖2）。分別為測試孔隙率、降解性能、體外礦化活性的5mm×5mm×5mm 的塊狀支架，測試抗壓強度（CS）的10mm×10mm×10mm 的塊狀支架，測試抗彎強度（BS）的25mm×5mm×5mm 的長條形支架。實驗中，去除有堵孔、支架坍塌等有缺陷的試件。

1.3.5多孔生物玻璃（BG）支架孔隙率的測定

根據阿基米德原理，多孔BG 支架的孔隙率按照公式1 進行計算，每組10個試樣，最后孔隙率為10個試樣孔隙率的平均值。

式中：P－孔隙率，% ma-試樣干重，g

mb-飽和試樣在水中的懸重，g mc-飽和試樣的質量，g

圖2 不同尺寸的試件

1.3.6 多孔生物玻璃（BG）支架抗壓強度（CS）及抗彎強度（BS）的測定 室溫干燥環境下，利用萬能力學試驗機測試。每組設10個平行樣，CS 采用單軸壓縮試驗測定（測試過程中要保證上下表面與探頭充分接觸），所用樣品為10mm×10mm×10mm 的立方體支架；BS 采用三點彎曲試驗測定，所用樣品為25mm×5mm×5mm 的長條形支架。測試加載速率均為0.5mm/min，最大載荷為5.0KN。最終的CS及BS為10個試樣的平均值。

試樣的CS按照公式2進行計算

σ＝P/S（公式2）

式中：σ－抗壓強度，MPa

P－試樣的破壞載荷，N

S－樣品與探頭的接觸面積，mm2

試樣的BS按照公式3進行計算。

σ=3Fl/(2bd^2)（公式3）式中：σ－抗彎強度，MPa

F－最大彎曲載荷，N l－跨距，mm

b－試樣的寬，mm d－試樣的高，mm

1.3.7 多孔生物玻璃（BG）支架降解性能的研究 通過測量各組多孔BG 支架在模擬體液（Simulated Body Fluid，SBF）中浸泡不同時間（1d、3d、7d）后的重量損失，來探究多孔BG 支架的降解性能。在濕度大于90%、溫度為37℃的恒溫箱中，將各組多孔BG 支架分別浸泡于SBF 溶液（PH=7.4）中，樣品質量與SBF 溶液體積比為1.0mg/mL，SBF 浸泡液每24h 更換一次。分別在1d、3d、7d后，取出樣品，用去離子水和無水乙醇沖洗，然后置于80℃的烘箱中干燥至恒重，測量樣品的質量損失［8］。本實驗設置1d、3d、7d三個時間節點，每個節點設5個平行樣。

試樣的失重比例按照公式4進行計算。

L%＝（m0-m1）/m0×100%（公式4）

式中：L%－質量損失百分比

m0－浸泡前樣品干燥質量，g

m1－浸泡后樣品干燥質量，g

1.3.8 多孔生物玻璃（BG）支架體外礦化活性的研究 首先，在無水乙醇中超聲蕩洗多孔BG 支架5min，置于空氣中自然干燥。然后，將各組多孔BG支架分別浸泡于裝有SBF溶液（PH=7.4）的聚乙烯瓶中（支架重量與SBF的比例為1.0mg/mL），置于濕度大于90%，溫度為37℃恒溫箱中，不更換SBF浸泡液，分別在1d、3d、7d后，取出支架，用去離子水和無水乙醇沖洗，然后在空氣中自然干燥。隨后利用掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）觀察各組多孔BG支架浸泡后的形貌與微觀結構的變化（測試前需在試件表面噴金，以增強多孔BG支架的導電性），各組材料分別隨機選取5個不同位置拍照；將多孔BG支架砸碎，用三頭研磨機研磨成粉末狀后利用X線衍射分析（X-ray Diffraction，XRD）樣品浸泡后的物相組成［8］。

1.4 統計學方法 使用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析，計量資料用（±s）表示，多組數據結果比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較用最小顯著性差異法（Least-significant difference，LSD）檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 ZnO 含量對多孔生物玻璃（BG）支架孔隙率的影響 采用單因素方差分析，A、B、C、D 四組多孔BG 支架的孔隙率無統計學差異（P=0.343＞0.05）。說明隨ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的孔隙率無差異（見表6）。

表6 含不同含量ZnO多孔BG支架的孔隙率（%）比較（-x±s）

2.2 ZnO 含量對多孔生物玻璃（BG）支架抗壓強度（CS）的影響 采用單因素方差分析，A、B、C、D四組多孔BG 支架的CS 有統計學差異（P=0.000＜0.05），進一步兩兩比較，有統計學差異（P＜0.05），說明隨ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的CS 逐漸下降（見表7）。

表7 含不同含量ZnO多孔BG支架的抗壓強度（MPa）比較（-x±s）

2.3 ZnO 含量對多孔生物玻璃（BG）支架抗彎強度（BS）的影響 采用單因素方差分析，A、B、C、D四組多孔BG 支架的BS 有統計學差異（P=0.000＜0.05），進一步兩兩比較，有統計學差異（P＜0.05），說明隨ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的BS 逐漸下降（見表8）。

表8 含不同含量ZnO多孔BG支架的抗彎強度（MPa）比較（-x±s）

2.4 ZnO 含量對多孔生物玻璃（BG）支架降解性能的影響 采用單因素方差分析，A、B、C、D 四組多孔BG 支架在SBF 中浸泡7d 的失重比例有統計學差異（P=0.000＜0.05），進一步兩兩比較，A 組與B 組比無統計學差異（P=0.164＞0.05），其余各組兩兩之間均有統計學差異（P＜0.05）。說明在SBF中浸泡7d 后，隨ZnO 含量的增加，多孔BG 支架的降解性能逐漸增強（見表9，見圖3）。

表9 含不同含量ZnO的多孔BG支架在SBF中浸泡7d的失重比例（%）比較（-x±s）

圖3 含不同含量ZnO的多孔BG支架在SBF中的失重曲線

2.5 ZnO含量對多孔生物玻璃（BG）支架羥基磷灰石（HA）沉積的影響 圖4為含ZnO多孔BG支架在SBF中浸泡不同時間后的SEM照片。從圖中可以看出，在SBF中浸泡7d后，A組（圖4a）表面只沉積了少量顆粒，沒有形成HA薄膜。浸泡7d后，B組（圖4b）表面見顆粒沉積，與A組相比，尺寸稍大一些，也未見HA薄膜形成。浸泡3d（圖4c）后，C組表面即見顆粒沉積，7d（圖4d）后，表面形成HA薄膜。浸泡1天（圖4e）后，D組表面即見大量顆粒沉積，3d（圖4f）后，表面形成典型的HA薄膜。

圖4 含ZnO多孔BG支架在SBF中浸泡后的SEM照片（a）A組，7d；（b）B組，7d；（c）C組，3d；

（d）C組，7d；（e）D組，1d；（f）D組，3d.

對浸泡后樣品的XRD 分析證實了SEM 的觀察結果。浸泡7d 后，A 組（圖5a）、B 組（圖5b）多孔BG 支架XRD 圖譜與浸泡前相似，均為饅頭峰，表明多孔BG 支架仍為無定形態結構，表面沉積的顆粒并未形成結晶態的HA。浸泡前C 組（圖5c）多孔BG 支架的XRD 圖譜為饅頭峰，浸泡3d 后，仍為彌散性較強的漫散射峰，浸泡7d后，XRD圖譜上出現了衍射峰，經對照，分別為HA（002）晶面和（211）晶面的特征衍射峰，表明表面的沉積物已轉化為晶態HA。浸泡前D 組（圖5d）多孔BG 支架的XRD圖譜為饅頭峰，浸泡1d 后，仍為彌散性較強的漫散射峰，浸泡3d 后，XRD 圖譜上出現了衍射峰，經對照，分別為HA（002）晶面和（211）晶面的特征衍射峰，表明表面的沉積物已轉化為晶態HA。說明隨ZnO 含量的增加，多孔BG 支架體外礦化活性逐漸增強。

3.討論

3.1 Al2O3對生物玻璃（BG）性能的影響 郭宏偉等［9］通過研究Al2O3含量對無堿鋁硼硅玻璃網絡結構的影響得出，Al2O3作為網絡中間體，通過與硅氧四面體［SiO4］相連，將斷裂的Si-O 網絡連接起來，使結構網絡增加，使更多的網絡修飾體可以進入玻璃網絡，使玻璃網絡結構變得緊密。因此，在一定范圍內，隨Al2O3含量的不斷增加，玻璃的網絡結構變得更加完整，使得玻璃的強度不斷增強。但是，有研究表明，玻璃的生物活性會因為其網絡結構的增強而下降，甚至變為生物惰性。Andersson等［10］認為，鋁離子溶解后會與周圍組織相結合，從而占據玻璃與組織的結合位點；鋁離子會占據Ca2+、PO43-與富硅層的結合位點，從而降低玻璃表面富硅層的交聯度；鋁離子還會與富鈣、磷層結合，形成與骨中的HA 不相容的復合物，這就解釋了為什么Al2O3的引入會使玻璃的生物活性下降。

3.2 ZnO 對生物玻璃（BG）性能的影響 本研究發現，隨著氧化鋅含量增加, BG 支架的抗壓強度（CS）和抗彎強度（BS）均下降，而郭煒煌［8］將2wt%的四角狀氧化鋅加入到BG/明膠復合支架中，卻顯著增強了復合支架的CS 和BS，這種結果差異是由四角狀氧化鋅和普通氧化鋅的結構差異導致的，與普通氧化鋅相比，四角狀氧化鋅具有獨特的四針狀結構，依靠此結構可以使其緊密包裹于BG 支架中，從而增強BG 支架的網絡結構，進而增強BG 的機械強度［11］。因此，后續實驗可將不同尺寸形態的氧化鋅加入到BG 中，研究不同尺寸形態的氧化鋅對BG性能的影響。

圖5 含ZnO多孔BG支架在SBF中浸泡后的XRD 圖譜

Shepherd DV 等［12］研 究 發 現，鋅 可 以 激 活Runx2基因表達，抑制骨髓間充質細胞向破骨細胞樣細胞轉化，還可以啟動成熟破骨細胞凋亡來抑制破骨細胞骨吸收進程。Zhao 等［13］采用傳統熔煉鑄造技術，制備出含鋅硼酸鹽BG 支架，該BG 支架與人骨小梁有著類似微結構，對該含鋅硼酸鹽BG 支架進行體外細胞培養，結果表明，含鋅BG可以促進堿性磷酸酶的分泌表達，進而促進人間充質干細胞的增殖和分化。對鼠顱骨缺損修復實驗進一步證實，含鋅BG 組骨再生能力顯著高于不含鋅BG 組。本課題組后續將對制備的多孔BG 支架進行體外細胞培養及動物體內實驗，進一步研究ZnO 取代Al2O3對多孔BG 支架生物相容性、成骨細胞增殖能力及體內降解性能的影響，找到ZnO 取代Al2O3的最適宜量，使機械強度、生物活性及生物相容性有效結合，使多孔BG 支架材料的降解速度與成骨速度相匹配，從而為開展新型高強度BG 骨修復支架材料的研究和相關產品開發提供一定的理論支持。

3.3 實驗結果討論 影響生物玻璃（BG）性能的決定因素是玻璃的Si-O 網絡結構［14］，而鋅離子正是通過調節BG 的Si-O 網絡來影響其性能。ZnO 取代Al2O3會使玻璃網絡中出現更多的斷點，使玻璃網絡的完整性下降，進而促進玻璃的離子釋放和降解，促進羥基磷灰石（HA）的形成，因此，本實驗中，隨著ZnO 取代Al2O3含量的增加，多孔BG支架的降解性能及體外礦化活性逐漸增強。這與杜瑞琳［14］用ZnO 取代58S 玻璃中的CaO 得出，隨ZnO 含量的增加，58S 玻璃的降解速度和HA 沉積下降，結論不一致。分析原因為，ZnO、Al2O3、CaO對玻璃Si-O 網絡結構的影響不同，ZnO 取代Al2O3，使玻璃網絡的完整性下降，故而促進玻璃的降解和HA 沉積；而ZnO 取代CaO，使玻璃的網絡結構更緊密，從而限制玻璃的降解和HA 沉積，因此會出現不一致的研究結果。

A 組與B 組BG 分別含有3wt%和2wt%的Al2O3，A、B兩組BG在SBF中浸泡7d后均未見HA形成，故A、B 兩組BG 無體外礦化活性，即玻璃中含有少量的Al2O3就會使玻璃喪失生物活性。這與Hench［15］研究發現，當45S5 玻璃中Al2O3含量達到3wt%時，BG即失去生物活性，結果一致。

A、B、C、D 四組多孔BG 支架都具有較高的孔隙率（超過50%），各組之間沒有明顯的差異，并且均在人體松質骨的孔隙率范圍內，符合人工骨材料的要求。分析其原因為，本實驗采用有機泡沫浸漬法制備多孔BG支架，漿料主要粘附在海綿骨架上，在燒結過程中，海綿揮發而不留下多余雜質，故獲得的多孔BG 支架具有與泡沫海綿類似的結構，因此，多孔BG 支架的孔隙率主要受聚氨酯海綿尺寸的影響［16］。另外，在用有機泡沫浸漬法制備多孔BG 時，掛漿料的方法也會對多孔玻璃的孔隙率產生影響。若沒有讓有機泡沫充分吸收料漿，掛漿料少，燒成時容易使多孔玻璃支架坍塌，不能得到完整的支架；若掛漿料過多，則容易引起堵孔的現象，從而影響孔隙率的大小。因此，為了防止堵孔或玻璃支架坍塌，保證料漿能夠在有機泡沫上均勻分布，常采用手工擠壓、離心法、吸附法等來進行漿料浸漬［7,17］。

隨著ZnO 取代Al2O3含量的增加，多孔BG 支架的抗壓強度（CS）及抗彎強度（BS）不斷下降，D組多孔BG 支架僅能達到人體松質骨CS及BS的下限，仍不能用于承載骨方面的修復。這與Oki 等［18］的研究發現，隨ZnO含量的上升，BG支架材料的強度會下降，結果一致。分析原因，這與Al2O3含量的下降也有關，Al2O3含量下降，會使玻璃網絡的完整性下降，從而使玻璃的強度下降［9］。

僅本研究結果而言，ZnO 取代Al2O3對多孔BG支架的孔隙率影響較小，孔隙率主要受聚氨酯海綿尺寸的影響。ZnO 取代Al2O3會降低多孔BG 支架的抗壓強度及抗彎強度，當ZnO 完全取代Al2O3時，BG 支架僅能達到人體松質骨的最低機械強度要求，因此，需要進一步調整BG 的化學組分來提高其機械強度。ZnO 取代Al2O3能增強多孔BG 支架的降解性能及體外礦化活性，為后續進行細胞體外培養及動物體內實驗提供了實驗基礎，為開展新型生物玻璃骨修復支架材料的研究和相關產品開發提供一定的理論支持。