TGF-β對衰老小鼠腸道功能作用的初步研究*

呼 峰 李珊珊 周偉偉 胡 磊 夏登勝

隨著人口老齡化的到來，我國已開始步入老齡化社會。人隨著年齡的增長，機體的生理功能開始逐漸下降，口腔各組織結構也會出現相應的增齡性變化［1］，如牙體牙周、黏膜、牙齦、頜骨、肌肉、皮膚、關節等的衰老［2］，這些組織的衰老不僅可直接導致老年口腔疾病, 如齲病、牙周病、黏膜病等，影響老年人進食，進而對全身健康造成不利影響，還可直接影響到老年人口腔疾病的診斷與治療。

胃腸是機體攝取營養的主要場所，每天必須消化、吸收人體中的食物，以提供體內器官與細胞足夠的養分。一旦腸道開始老化，全身其他組織器官也將隨之衰老。腸道衰老可導致組織結構和功能性黏膜防御缺陷、組織氧化應激增加、保護性免疫能力下降、炎癥［3-5］，嚴重影響了老年人群的生活質量和身體健康，同時還可直接或間接引起和加重某些器質性疾病如消化道腫瘤、心腦血管意外和心理疾患等的發生、發展。因此，預防腸道衰老對全身系統及口腔健康均有重要作用。

Franceschi等［6］于2000年提出炎性衰老的概念，認為衰老是一種慢性、無菌、低度的炎癥。Salvioli等［7］發現促炎癥細胞因子在衰老中起到獨特作用。有報道稱，老人體內促炎因子的水平是年輕人的2～4倍［8］。慢性炎癥升高組織內ROS水平，而ROS可導致DNA錯誤復制、環境刺激致基因損傷［9］。此外，組織損傷促進細胞分泌更多促炎因子［腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素（interleukin，IL）等］加重炎癥［10］。研究發現，腸道黏膜內炎癥和抗炎細胞因子之間的平衡與腸道衰老密切有關，已發現部分與腸道衰老相關的促炎細胞因子，如IL-1b、IL-6和TNF-α［11-13］。轉化生長因子β（transforming growth factor-β, TGF-β）是一種具有多種功能的蛋白多肽，它廣泛存在于動物各種正常組織細胞以及各種轉化細胞中，可以調控細胞的遷移、粘附，刺激胞外基質的合成，對多種類型細胞的增殖分化起促進作用［14，15］。研究證實，TGF-β家族在衰老方面發揮著至關重要的作用［16］。但炎癥細胞因子在腸道衰老中的具體作用仍不清楚。本實驗將通過觀察小鼠生理衰老過程中組織學及炎癥因子表達的增齡性變化，初步研究炎性細胞因子對小鼠腸道衰老的作用。

1.材料和方法

1.1 實驗材料2、6、18月齡SPF級C57雄性小鼠（北京維通利華提供）；TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17 和INF-γELISA 試劑盒（達科為，中國）；CBA試劑盒（BD，美國）；RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑（Sigma，美國）；TGF-β1抗體（Abcam，美國）；抗兔IgG-HRP(Santa Cruz，美國)；DAB 顯色試劑盒（CST，美國）；10%水合氯醛（國藥，中國）。本實驗操作符合首都醫科大學附屬北京口腔醫院動物實驗倫理操作要求。

1.2 實驗儀器 倒置熒光顯微鏡（Nikon，日本）；流式細胞儀（BD，美國）；高速離心機（Thermo Fisher，美國）。

1.3 小鼠小腸上皮組織學觀察2、6、18月齡雄性C57小鼠各10只，飼養1周，觀察各小鼠飼養期間糞便性狀［17,18］；1周后10%水合氯醛（劑量0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，取小鼠胃部以下10mm 處小腸，經多聚甲醛4℃固定過夜后脫水、浸蠟、石蠟包埋。按5μm連續切片。切片經二甲苯15min，100%無水乙醇3min，90%酒精3min，75%酒精3min，梯度酒精脫蠟至水。蘇木素染5min后，水洗，PBS 浸泡5min，伊紅染色2min，水洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.4 血清中炎癥相關細胞因子檢測 選取年輕小鼠（2月齡）和衰老小鼠（18月齡）各10只，10%水合氯醛（0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，取小鼠小腸，加入RIPA細胞裂解液和蛋白酶抑制劑，勻漿裂解30min 后，上離心機離心，收集上清液。上清液于-80℃下保存備用。采用CBA法流式檢測上清液中細胞因子含量，經相應ELISA試劑盒進行驗證。

免疫組化：小鼠組織切片經脫蠟浸水后，經檸檬酸鈉緩沖液抗原修復10min。經封閉1h，加入TGF-β1抗體孵化過夜。再加入抗兔IgG-HRP，用DAB顯色試劑盒顯色，倒置顯微鏡下觀察拍照，Image J進行分析。

1.5 TGF-β 對衰老小鼠小腸上皮的作用 選取衰老小鼠（18月齡）的小鼠20 只，隨機分為兩組，每組10 只。TGF-β 組：小鼠腹腔注射TGF-β（100ng/kg），每周注射1次，注射4次。對照組：小鼠腹腔注射生理鹽水（100ng/kg），每周注射1次，注射4次。兩組小鼠常規飼養1個月后，10%水合氯醛（劑量0.2ml/kg）腹腔注射麻醉后脫頸處死，取小鼠胃部以下10mm 處小腸，切片、HE 染色后，倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.6 統計學分析 使用SPSS 21.0 進行數據分析，糞便性狀指數比較采用卡方檢驗，細胞因子水平比較采用t 檢驗，柱狀圖采用Graphpad 6.0 制作。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 衰老小鼠小腸上皮組織學改變 小鼠隨著年齡增長，小腸上皮出現萎縮，厚度明顯減小。與2月齡及6月齡小鼠相比，18月齡小鼠糞便性狀發生改變，糞便逐漸變軟、不成型，提示衰老小鼠消化吸收功能逐步退化（圖1）。

圖1 小鼠小腸上皮組織增齡性改變A：小鼠小腸上皮2、6、18月齡組織學變化（標尺：100μm）；B：小鼠糞便性狀改變

2.2 年輕和衰老小鼠小腸上皮中細胞因子水平變化 由圖2可知，與年輕小鼠相比，衰老小鼠小腸上皮組織中TGF-β、TNF-α、IL-2、4、6、10、17和干擾素γ（INF-γ）8種細胞因子表達發生變化。衰老小鼠組織上清液中僅TGF-β表達水平出現明顯下降，和年輕小鼠相比，差異有顯著性（P＜0.05）；而其余細胞因子表達水平均提高，其中TNF-α、IL-4和IL-6的細胞因子水平有統計學差異（P＜0.05）；IL-2、IL-10、IL-17和INF-γ的細胞因子水平沒有顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 小鼠小腸免疫組化結果 免疫組化結果顯示：年輕小鼠小腸上皮層、黏膜下層、肌層和漿膜均有大量TGF-β表達，其中在管狀腸腺的底部TGF-β高表達，提示TGF-β可能與小腸上皮的細胞更新密切相關。衰老小鼠小腸各區域中TGF-β表達水平明顯低于年輕小鼠（P＜0.05）（圖3）。

圖2 年輕小鼠和衰老小鼠小腸上皮中細胞因子水平A:TGF-β；B：TNF-α；C：IL-2；D：IL-4；E：IL-6；F：IL-10；G：IL-17；G：INF-γ

圖3 年輕小鼠和衰老小鼠小腸上皮A：年輕小鼠免疫組化結果（標尺：100μm）；B：衰老小鼠免疫組化結果（標尺：100μm）；C：小腸上皮中TGF-β表達水平

2.4 TGF-β對衰老小鼠小腸上皮的作用結果

利用衰老小鼠腹腔注射TGF-β，1個月后組織學發現，與對照組相比，TGF-β注射組小鼠小腸上皮萎縮明顯改善，厚度明顯增高。ELISA 檢測發現TGF-β組衰老小鼠小腸組織中TGF-β的表達水平明顯高于對照組（P＜0.05），同時TGF-β組小鼠的糞便成型，較對照組有明顯改善（P＜0.05）。說明TGF-β可以促進衰老小鼠小腸上皮的吸收功能，延緩衰老進程。

圖4 衰老小鼠腹腔注射TGF-β 1個月后的變化A:對照組和TGF-β組的鏡下結果（標尺：200μm）；B：對照組和TGF-β組組織上清液中TGF-β的表達水平；C：對照組和TGF-β組小鼠糞便性狀指數

3.討論

衰老是生物的自然變化規律，隨著年齡增長，人體器官功能逐步減退。老年人因牙周炎缺牙而導致咀嚼功能下降［19］，舌乳頭減少使味覺改變，唾液腺腺泡減少和萎縮而導致口干［2，20，21］，進而影響全身健康。而且老年人普遍存在消化吸收和免疫功能減退的情況，會影響營養攝取，與小腸上皮黏膜的變化有密切聯系［22］。炎癥細胞因子既參與口腔黏膜的凋亡，同時也可以促進黏膜的重建和修復［23，24］，但炎癥細胞因子是對于腸道衰老的機制尚不完全清楚。

本研究觀察到小鼠正常生理衰老情況下小腸上皮出現萎縮，糞便性狀改變，呈現出變軟和不成型的形態，說明小鼠小腸隨著年齡增長，小腸消化吸收功能減退，這跟小鼠小腸上皮黏膜細胞增殖能力下降，增殖減慢，杯狀細胞、潘氏細胞和干細胞數目減少有關［22，25］。有學者發現，小腸上皮干細胞線粒體DNA的突變與年齡有關，這種基因突變會影響小腸上皮干細胞呼吸鏈的功能進而加速細胞的凋亡，進而導致腸黏膜的厚度在老化過程中逐漸下降［26］。為了證實和篩選影響小鼠腸道功能的炎癥細胞因子，本研究對小鼠小腸上皮組織上清液中細胞因子進行流式細胞檢測和ELISA 檢測，篩選出TGF-β、TNF-α、IL-2、4、6、10、17和INF-γ8種細胞因子。本研究中衰老小鼠小腸中TGF-β比年輕小鼠明顯降低，有統計學意義；其余細胞因子表達水平均較年輕小鼠提高，其中TNF-α、IL-4和IL-6的細胞因子水平有統計學差異，IL-2、IL-10、IL-17和INF-γ的細胞因子水平沒有顯著性差異。說明在小鼠小腸上皮增齡性變化中TGF-β、TNF-α、IL-4和IL-6可能起到了一定作用。

TGF-β是一類具有強烈刺激細胞增殖分化的生長因子，具有廣泛的靶細胞，對上皮細胞、成纖維細胞和內皮細胞具有明顯的生物學作用［27］。研究發現TGF-β是間充質干細胞重要的調節分子，影響干細胞的增殖，自我更新與多向分化［28，29］，對胚胎發育、細胞增殖、衰老、腫瘤發生等生長調控及創傷愈合起到重要作用。TGF-β可以促進口腔黏膜重建和修復，延緩口腔黏膜的細胞衰老。有研究證實，TGF-β1能促進大鼠口腔黏膜固有層前體細胞的分化，提高細胞基質分泌和礦化能力［17］。TNF-α是一種重要的促炎因子和免疫應答調節劑，在炎癥反應及骨病理、生理過程中起重要的作用，并且炎癥因子可以通過多種復雜信號通路調控干細胞的生物學特性［30］。白細胞介素是一類來源于單核-巨噬細胞的多功能生物活性物質，屬于前炎癥細胞因子，能夠引發宿主免疫反應，誘導細胞凋亡［31］。INF-γ屬于Th1型細胞因子，其主要用于介導免疫應答［32］。何玉廷等［33］發現，IL-4、IL-6和TNF-α均被作為炎性衰老的血清學標志物。但也有學者發現，SD大鼠血清中IL-2含量降低，18、24月齡開始差異有顯著性， IL-6、IL-10含量逐漸升高，24月齡時差異有顯著性， IL-4，INF-γ含量未見明顯改變［34］。向婷婷等［35］發現IL-6、IL-17、TNF-α和INF-γ的表達隨著大鼠年齡的增長，表達逐漸增加。上述實驗說明小鼠小腸上皮增齡性改變可能存在多種細胞因子調節。本實驗只選擇TGF-β一種細胞因子進行初步研究。

本研究免疫組化驗證，衰老小鼠小腸上皮表達的TGF-β有明顯減少。衰老小鼠腹腔注射TGF-β后，小腸上皮中TGF-β含量得到明顯提升，小鼠小腸上皮黏膜萎縮和糞便性狀均得到改善，說明TGF-β具有延緩小鼠小腸上皮衰老的作用，可以促進小腸營養吸收。生長分化因子11（GDF11）是TGF-β家族的一員，在多種器官和組織中表達，TGF-β/Smad通路通過激活p21基因誘導細胞周期阻滯來干預哺乳動物胚胎發育期間的程序性衰老，可延緩心臟、骨骼肌、大腦、骨骼、血管等多個器官和組織的衰老進程［36］，與本實驗研究結果一致。

研究機體衰老對于全身健康，特別是對老年人的生活質量有著重要意義。通過研究衰老小鼠小腸組織形態學和炎癥因子水平變化，以及TGF-β對小腸上皮衰老的延緩作用，小腸營養吸收功能得到改善，對于機體穩態平衡有著積極的作用。本實驗僅研究了TGF-β在衰老小鼠腸道功能退化中的影響，今后的實驗中還會深入研究其他細胞因子對口腔黏膜以及腸道上皮的調節機制。