結腸癌組織中MEG8、TGM2 mRNA的表達變化及其意義

譚智軍，趙玉國，肖曉艷

郴州市第一人民醫(yī)院，湖南郴州 423000

結腸癌屬于消化道常見的惡性腫瘤，在我國的發(fā)病率和病死率逐年上升，是威脅人類生命健康的重要隱患[1]。結腸癌在起病初期并無特異性癥狀，確診時癌癥多已進展或轉移，放化療等治療效果不佳，患者預后較差。長鏈非編碼RNA(lncRNA)屬于非編碼RNA，其長度超過200 nt，在基因組印記、轉錄激活以及染色質沉默等過程中發(fā)揮重要作用;母源性表達基因8(MEG8)的本質是一種lncRNA，主要位于人14號染色體(14q32)的DLK1-DIO3印記區(qū)，對胚胎和腦組織的發(fā)育具有重要的調控作用[2]。研究[3]表明，肺癌細胞株中MEG8可通過轉化生長因子-β抑制上皮間質轉化過程(EMT)，從而抑制腫瘤的進展。轉谷氨酰胺酶2(TGM2)是一種多功能的鈣依賴性交聯酶，通過使鳥嘌呤三核苷酸磷酸去磷酸化和鳥嘌呤二核苷酸磷酸磷酸化，介導信號通路轉導，參與細胞生長和發(fā)育[4]。研究[5-6]表明，細胞外的TGM2通過結合鈣離子激活自身轉酰胺基酶活性，促進細胞外基質交聯，有利于細胞黏附，從而促進腫瘤細胞進展。MEG8和TGM2在結腸癌中研究極少，二者是否具有相關性及與患者預后的關系尚不清楚。2014年1月—2015年4月，我們觀察了結腸癌組織中MEG8、TGM2的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取郴州市第一人民醫(yī)院收治的結腸癌患者85例，男43例，女42例；年齡(58.21±8.47)歲，其中≥60歲者45例、<60歲者40例。納入標準：①患者均符合《世界衛(wèi)生組織腫瘤分類診斷系統》[7]中結腸癌的診斷標準且術后病理結果為結腸癌；②既往無腸道手術史或放化療史；③所有患者的一般資料齊全，自愿協助本次研究，且按時接受隨訪。排除標準：①合并腸道淋巴瘤、腸結核或克羅恩病者；②合并其他原發(fā)惡性腫瘤者；③嚴重惡病質不能耐受手術者；④肝腎功能不良者；⑤先天免疫功能異常者。腫瘤≤3 cm者35例，腫瘤>3 cm者50例；淋巴結轉移者10例，無淋巴結轉移者75例；高分化者34例，中分化者43例，低分化者8例；TNM分期Ⅰ期33例，Ⅱ期40例，Ⅲ期7例，Ⅳ期5例。所有患者隨訪時間均為1～60個月，隨訪截止時間為2020年4月，隨訪過程中無失訪病例。手術留取結腸癌組織及其癌旁正常組織各85例份。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，且所有結腸癌患者均簽署知情同意書。

1.2 結腸癌組織中MEG8、TGM2 mRNA檢測方法 采用熒光實時定量PCR法檢測。取結腸癌組織及其癌旁正常組織各30 mg，將1 mL的TRIzol試劑(Invitrogen公司)滴入研磨好的組織中，依照操作規(guī)程提取總RNA。將提取的10 μg總RNA，通過反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)轉化為cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒(TaKaRa公司)定量檢測MEG8和TGM2。MEG8和TGM2的反應條件均為37 ℃、30 min，85 ℃、15 s。PCR反應體系：2×SYBR Green Master為10 μL、正反引物均為1 μL、cDNA template 1.0 μL以及dH2O 7 μL，共計20 μL。MEG8正向引物序列：5′-ATCTCCAGCCTTGACTCTGACAC-3′，反向引物序列：5′-GAGGACGATGTACCAGGGTGCAGAGTG-3′；內參基因β-actin的正向引物序列：5′-GAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′，反向引物序列：5′-TAGTTTCGTGGATGCCACAGG-3′；TGM2正向引物序列：5′-ACCGCTGAGGAGTACGTCTG-3′，反向引物序列：5′-CAGAGAAAGGCTCCAGGTTG-3′；內參基因GAPDH正向引物序列：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物序列：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。MEG8和TGM2的PCR反應條件均為95 ℃預變性10 min，95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，共計40個循環(huán)，每個樣本設置3個復孔。由上海吉凱基因公司負責制備引物序列。通過相對Ct值法進行檢測MEG8、TGM2 mRNA，結果以Ct值表示，相對于β-actin或GAPDH的比值為2-ΔΔCt，其中Ct=C目的基因-Ct內參基因。

2 結果

2.1 結腸癌及其癌旁正常組織MEG8、TGM2 mRNA相對表達量比較 結腸癌及其癌旁正常組織MEG8 mRNA相對表達量分別為0.62±0.23、1.87±0.55，TGM2 mRNA相對表達量分別為2.03±0.95、0.98±0.36，兩者比較，P均<0.05。

2.2 MEG8、TGM2 mRNA表達與結腸癌臨床病理參數的關系 結果見表1，由表1可知，MEG8、TGM2 mRNA表達均與結腸癌TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

表1 MEG8、TGM2 mRNA相對表達量與結腸癌臨床病理參數的關系

2.3 結腸癌組織MEG8 mRNA、TGM2 mRNA的表達相關性 Pearson線性相關分析結果表明，結腸癌組織中MEG8 mRNA和TGM2 mRNA表達呈顯著負相關(r=-0.798，P<0.05)。

2.4 組織MEG8、TGM2 mRNA表達與結腸癌患者生存、預后的關系 以結腸癌組織中MEG8表達量的中位數0.63為臨界值，其中高表達者45例，低表達者40例，高表達者5年總生存率為77.78%(35/45)、生存時間為(43.62±8.31)個月，低表達者分別為52.50%(21/40)、(31.07±7.25)個月，兩者比較，P均<0.05。以結腸癌組織中TGM2表達量的中位數2.01為臨界值，其中高表達者44例，低表達者41例，高表達者5年總生存率為54.55%(24/44)、生存時間為(37.21±9.68)個月，低表達者分別為78.49%(32/41)、(49.18±8.76)個月，兩者比較，P均<0.05。結腸癌患者預后Cox回歸模型分析結果見表2，由表2可知，高級別TNM分期、有淋巴結轉移、MEG8 mRNA低表達、TGM2 mRNA高表達是影響結腸癌患者預后的獨立危險因素(P均<0.05)。

表2 結腸癌患者預后Cox回歸模型分析結果

3 討論

結腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中分別位居2、3位，且仍有繼續(xù)上升的趨勢[8]。結腸癌是多種因素共同作用的結果，其中以遺傳基因、生活方式、地域差異、飲食結構為主。目前，手術切除腫瘤聯合放化療仍是臨床中結腸癌最常用的治療手段，然而由于結腸血供豐富、周圍臨近器官及淋巴結較多，使癌癥易于累及周圍器官并經血液或淋巴系統向遠處轉移，因此常規(guī)治療效果較差，復發(fā)率較高，導致患者預后不良。表觀遺傳學是目前癌癥領域的研究熱點，對早期輔助診斷、評估病情以及預測患者預后具有重要作用。既往研究表明[9-10]，lncRNA、DNA甲基化、DNA拷貝數改變以及組蛋白修飾等過程不僅能夠參與腫瘤細胞分裂分化，還可以調控腫瘤微環(huán)境，提高正常細胞癌變的風險。

lncRNA是結構高度保守的非編碼RNA，能夠參與核內運輸、轉錄干擾以及轉錄激活等過程，對細胞定向分化、機體生長發(fā)育以及亞細胞結構分布等方面具有重要的調控作用。MEG8屬于母源性等位基因，與MEG3共享DLK1-DIO3位點，主要包含微小RNA-341、微小RNA-1188及miR-370，能夠調控胚胎發(fā)育和血管生成[3]。研究[11]表明，MEG8能夠靶向作用其海綿基因，誘導過氧化物酶體增殖激活受體α蛋白表達，抑制血管平滑肌細胞增殖或遷移，能夠有效調節(jié)血管動脈粥樣硬化。在質粒轉染試驗中發(fā)現，MEG8能夠明顯降低δ樣1同源物(DLK1)的轉錄水平，而DLK1在非小細胞肺癌中呈高表達，能夠誘導血細胞異常增殖，起原癌基因的作用，因此，能夠負向調控DLK1的MEG8具有抑癌基因的作用[12]。本研究顯示，結腸癌組織中MEG8低表達，且與TNM分期及淋巴結轉移有關，表明MEG8可能參與了結腸癌的發(fā)生。其原因可能為癌組織中的MEG8自身發(fā)生甲基化，導致轉錄后沉默，從而使自身表達量下調[3]。同時MEG8表達下調后能夠激活Notch信號通路，誘導核內轉錄因子活化，促進表皮生長因子表達，從而加速癌細胞分裂及增殖[9]。此外，下調的MEG8對果蠅Zeste基因增強子人類同源物2(EZH2)蛋白及上皮間質轉化的抑制能力減弱，使癌細胞易于透過基底膜向周圍組織器官侵犯，促進癌癥遷移[13]。

TGM2屬于轉谷氨酰胺酶家族，通過結合多肽鏈合成不可逆的ε-賴氨酸，促進Ca離子依賴的翻譯后蛋白修飾，從而調控細胞多種生命活動。TGM2能夠穩(wěn)定細胞外基質結構并重建細胞骨架，對維持細胞功能及增殖分化具有重要作用[14]。在胃癌組織中，TGM2通過介導細胞外調節(jié)激酶1/2信號通路誘導癌細胞分裂分化，并促進其轉移[15]。研究[16]表明，TGM2能夠誘導癌細胞向基質細胞轉化，從而加速癌細胞侵襲，同時使癌細胞增強對化療藥物的耐藥性。本研究顯示，結腸癌組織中TGM2 mRNA表達升高，且與TNM分期及淋巴結轉移亦有關，表明TGM2與結腸癌發(fā)生發(fā)展密切有關。文獻報道，TGM2能夠促進凋亡抑制蛋白(Bcl-2)并抑制凋亡促進蛋白(Bax)的表達，從而減少Bax同源二聚體生成，沉默細胞凋亡信號通路，促進癌細胞的增殖和分化[17-18]。此外，TGM2通過Wnt/β-catenin信號通路抑制E-鈣黏蛋白表達，從而激活EMT過程，使癌細胞與周圍正常細胞的極性消失，且分解細胞間連接，增強癌細胞向周圍組織侵襲及遷移的能力[19-20]。

結腸癌組織中MEG8和TGM2 mRNA表達呈顯著負相關，提示MEG8、TGM2 mRNA存在一定聯系，二者相互作用影響結腸癌進展。MEG8和TGM2內在調控機制仍不清楚，但研究發(fā)現二者均能夠參與EMT過程，影響EMT相關信號通路轉導，從而影響腫瘤的進展[3，21]。Kaplan-Meier生存曲線結果表明，低表達的MEG8和高表達的TGM2 mRNA患者的預后情況明顯更差，Cox回歸分析進一步證實MEG8和TGM2 mRNA與結腸癌患者預后有關，因此臨床可將MEG8和TGM2作為預后預測因子。

總之，結腸癌組織中MEG8呈低表達，而TGM2 mRNA呈高表達，且兩者均與TNM分期及淋巴結轉移有關，檢測此指標對評估患者病情及預后具有重要價值。