鼻咽癌患者血清中長鏈非編碼RNA GAS5的表達變化及其意義

陳正魯，鐘宇南，戴秋芹，陳梓宏，余忠華，羅海清

1廣東醫科大學附屬醫院，廣東湛江 524001；2廣東醫科大學

鼻咽癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其發病率具有顯著的區域性特點。全球范圍內以東南亞及我國兩廣地區最為多見[1]。由于鼻咽腔狹小，組織結構深藏，發病比較隱匿。文獻報道，臨床上70%鼻咽癌患者確診時已屬中晚期[2-3]。晚期鼻咽癌以系統化治療為主，患者預后較差。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是腫瘤相關的調控因子，調節腫瘤的進展[4]。長鏈非編碼RNA生長停滯特異性轉錄本5(lncRNA-GAS5)是一種抑癌基因，可抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲轉移，促進腫瘤細胞凋亡。lncRNA-GAS5在肝癌、大腸癌、卵巢癌等腫瘤中參與腫瘤細胞的侵襲、轉移等調控過程，發揮抑癌作用[5-7]，其異常表達與腫瘤發生發展密切相關。但是目前有關lncRNA-GAS5在鼻咽癌中作用機制的報道較為罕見。我們前期研究[8]顯示，lncRNA-GAS5在鼻咽癌組織中呈低表達，其表達水平與臨床病理參數密切相關，表明lncRNA-GAS5在鼻咽癌中發揮抑癌基因的作用，但其在鼻咽癌血清學中的研究鮮有報道。2015年3月—2018年12月，我們觀察了鼻咽癌患者血清中lncRNA-GAS5的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月—2018年12月廣東醫科大學附屬醫院收治的鼻咽癌患者56例，男36例，女20例；年齡17～72(48.01±6.01)歲，其中<60歲25例，≥60歲31例；TNM分期(2008年中國鼻咽癌分期版本)Ⅰ期11例，Ⅱ期18例，Ⅲ期15例，Ⅳ期12例；淋巴結轉移為N0 27例，N1～N3 29例；腫瘤直徑<3 cm 35例，≥3 cm 21例；腫瘤分化程度為低分化26例，中分化12例，高分化18例；所有患者均經活檢病理確診，且術前均未接受過任何放化療治療、靶向治療、免疫治療。另選同期健康體檢者42例，男27例，女15例；年齡18～68(45.23±5.68)歲；均無腫瘤史、家族史。本研究患者均知情并簽署知情同意書，另經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 血清lncRNA-GAS5檢測 取56例鼻咽癌患者和42例健康體檢者清晨外周靜脈血各5 mL，全血自凝4 h，后在常溫下以3 000 r/min的速度離心10 min，提取上清液，再在4 ℃下以12 000 r/min的速度離心10 min，提取血清，置于-80 ℃冰箱中保存，室溫解凍，后在4 ℃下以12 000 r/min速度離心10 min，吸取上清液200 μL，應用miRNeasy Serum/Plasma Kit提取血清總RNA。利用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(加州福斯特市Applied Biosystems)進行反轉錄合成第一鏈cDNA，RT-PCR反應在應用生物系統7900快速實時PCR系統中實現。反應條件：模板預95 ℃、30 s，變性：94 ℃、15 s，退火及擴增：60 ℃、30 s，共反應45個循環。以甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內對照。用比較循環閾值(CT)計算lncRNA-GAS5的表達。

2 結果

2.1 鼻咽癌患者、健康志愿者血清lncRNA-GAS5相對表達量比較 鼻咽癌患者、健康志愿者血清lncRNA-GAS5相對表達量分別為3.69±1.33、7.13±1.93，兩者比較，P<0.05。

2.2 血清lncRNA-GAS5表達與鼻咽癌臨床病理參數的關系 結果見表1。由表1可知，血清lncRNA-GAS5表達與鼻咽癌TNM分期、淋巴結轉移有關(P均<0.05)。

表1 血清lncRNA-GAS5相對表達量與鼻咽癌臨床病理參數的關系

2.3 血清lncRNA-GAS5表達與鼻咽癌患者預后的關系 單因素分析顯示，lncRNA-GAS5表達水平[HR(95%CI)為13.792(6.244～30.465)，P<0.05]、腫瘤直徑[HR(95%CI)為0.533(0.294～0.967)，P<0.05]、淋巴結轉移[HR(95%CI)為0.262(0.134～0.514)，P<0.05]、TNM分期[HR(95%CI)0.102(0.048～0.216)，P<0.05]與鼻咽癌患者預后有關，性別[HR(95%CI)為0.715(0.381～1.343)，P>0.05]、年齡[HR(95%CI)為0.612(0.336～1.114)，P>0.05]、腫瘤分化程度[HR(95%CI)為1.107(0.621～1.971)，P>0.05]與鼻咽癌患者預后無關；多因素分析顯示，lncRNA-GAS5的低表達[HR(95%CI)為6.526(2.132～19.980)，P<0.05]、腫瘤直徑≥3 cm[HR(95%CI)為0.430(0.230～0.806)，P<0.05]與鼻咽癌患者不良預后有關。

2.4 血清lncRNA-GAS5表達與鼻咽癌患者生存的關系 隨訪時間截至2019年12月，患者隨訪時間10～69個月，中位隨訪時間39個月。Kaplan-Meier結果顯示，血清lncRNA-GAS5高表達者(高于lncRNA-GAS5相對表達量的均值,2例)及低表達者(低于lncRNA-GAS5相對表達量的均值，27例)患者總生存期分別為50.3、27.5個月，兩者比較，P<0.05。

3 討論

鼻咽癌是具有明顯地域分布特點的頭頸部腫瘤，全球以東亞和東南亞地區多見，我國以南部地區流行為主，其是一種發生于鼻咽黏膜的上皮性癌[9]。鼻咽癌主要病理類型包括基底樣鱗狀上皮癌、角化性鱗狀上皮癌和非角化性鱗狀上皮癌。非角化性鱗狀上皮癌又可分為分化型和未分化型，其中未分化非角化性癌是最常見的病理類型。目前認為，鼻咽癌發生可能與EBV感染、宿主遺傳學和環境因素在內的多種因素有關。鼻咽癌早期發病及癥狀比較隱蔽，大部分患者就診時已經是中晚期，早期篩查、診斷、治療是鼻咽癌防治的重要策略之一。

近年大量研究表明，lncRNA與腫瘤的發病機制之間存在著密切關系。據有關文獻報道，lncRNA的表達改變與腫瘤的發生、發展和轉移密切相關[10]。有研究結果表明，一些lncRNA也可以作為循環lncRNA在全身循環中被檢測出來，它們的表達可能與鼻咽癌患者的生理和病理改變直接相關[11]。lncRNA-GAS5為lncRNA分子中的其中一類，其在癌癥組織和正常組織中的表達存在差異。lncRNA-GAS5可以通過一些信號通路發揮抑癌作用，其與多種腫瘤有顯著的相關性，包括前列腺癌[12]、乳腺癌[13]等，它在這些癌癥中可能起抑癌基因的作用。GEE等[14]發現，腫瘤中lncRNA-GAS5呈低表達，提示腫瘤患者預后不良。WANG等[15]發現，食管癌患者血清lncRNA-GAS5表達降低，其高表達通過滅活PI3K/AKT/mTOR途徑抑制食管癌細胞的增殖和遷移。研究[16]發現，非小細胞肺癌(NSCLC)患者血清lncRNA-GAS5中分離出外泌體(Exo-GAS5)，其在非小細胞肺癌中表達降低，表明Exo-GAS5可以作為理想的基于無創血清的標記物，用于識別早期NSCLC患者，間接證明lncRNA-GAS5同樣可以用做識別早期NSCLC患者的血清標志物。SHEN等[17]通過對比膠質母細胞瘤患者血清中lncRNA-GAS5的表達情況，發現血清中lncRNA-GAS5低表達的膠質母細胞瘤患者比高表達的膠質母細胞瘤患者生存率差。LI等[18]認為，大腸癌患者血清中lncRNA-GAS5顯著下調與細胞因子表達呈負相關，lncRNA-GAS5通過抑制的細胞因子IL-10和血管內皮生長因子來抑制大腸癌的發展。lncRNA-GAS5除了上述的功能外，其還能充當微小RNA(miRNA)的海綿競爭的內源性RNA，從而降低了miRNA的表達[19]。HE等[20]發現，lncRNA-GAS5是微小RNA-21(miR-21)的上游調節因子，它通過抑制部分miR-21調節腹主動脈瘤的形成。因此，lncRNA-GAS5可作為防止腹主動脈瘤形成的潛在靶點。研究[8]顯示，lncRNA-GAS5表達與鼻咽癌患者臨床病理參數及患者預后相關。

本研究分析了lncRNA-GAS5在鼻咽癌血清中的表達水平與臨床病理參數及預后的相關性。目前有關lncRNA-GAS5在鼻咽癌發病機制中的研究極少報道過。眾所周知，組織學檢查是癌癥診斷的金標準，可以通過鼻內鏡活檢或手術切除獲得，但其缺點在于檢查有創及價格昂貴，并且具有一定的風險。因此，臨床上尋找替代性的診斷技術是有必要的。血液作為生物流體的非侵入性腫瘤生物標記物自然引起了極大的興趣。本研究顯示，鼻咽癌血清lncRNA-GAS5表達低于健康志愿者，lncRNA-GAS5表達與鼻咽癌TNM分期及淋巴結轉移相關，這與之前課題組組織樣本的研究結果大體一致。另外，lncRNA-GAS5表達下調增強了鼻咽癌的的侵襲性進展。Kaplan-Meier分析顯示，血清lncRNA-GAS5高表達患者的總生存期顯著高于低表達者，這與Shen等[22]報道的血清lncRNA-GAS5在膠質母細胞瘤的表達結果類似。同時COX回歸分析顯示，lncRNA-GAS5表達量的高低及腫瘤直徑對鼻咽癌患者的預后有較好的預測能力。由此我們可以認為，lncRNA-GAS5可作為鼻咽癌患者生存預后的血清生物學標志。

總之，鼻咽癌患者血清中lncRNA-GAS5表達降低，其表達與鼻咽癌TNM分期、淋巴結轉移及患者預后、生存密切相關，此指標可作為鼻咽癌患者新的預后標志物。