低氧環境對椎間盤自發性吸收的影響及其作用機制

盧巖凱 陳宏亮 袁峰 陳聆華 谷濤 邵禮暉 范煜昕

臨床上大部分腰椎間盤突出癥患者通過保守治療后可獲得較為令人滿意的生活質量。但是，對腰椎間盤大塊突出患者，尤其是當突出物對硬膜囊的壓迫超過1/3使神經根受到明顯擠壓時，手術治療效果更好[1]。隨著醫學影像學的發展，腰椎間盤大塊突出組織自發性吸收的相關報道越來越多[2-3]。腰椎間盤突出組織自發性吸收可以被認為是腰椎間盤突出癥的自然轉歸，但臨床上這一現象的發生仍有偶然性。關于是否存在促進椎間盤組織自發性吸收的微環境及其作用機制目前仍不明確。缺氧誘導因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是缺氧反應的主要調節劑。在缺氧條件下，其調節亞基缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的降解受到阻礙，在細胞中迅速聚集[4]。同時，HIF-1α的活性增強，移至細胞核，與HIF-1結合并形成活化的HIF-1蛋白質。HIF-1參與細胞存活和凋亡的平衡調節，在細胞凋亡過程中發揮的作用隨細胞類型不同而變化[5]。在不同細胞中，HIF-1顯示出促進或抵抗細胞凋亡的不同效果。水通道蛋白(aquaporin，AQP)是具有選擇性水滲透性的膜通道蛋白質家族，與晶狀體的主要內在蛋白質同源[6]。在缺氧條件下水通道蛋白3(AQP3)的表達下降，而在復氧后會增加[7]。本研究在不同時效低氧環境下培養兔髓核細胞，觀察各組髓核細胞中HIF-1α、3 型酸敏感離子通道(acid-sensing ionchannel 3，ASIC3)及AQP3的表達，通過對髓核細胞凋亡率的檢測探討促進自發性吸收的最優環境及其可能機制，以期為臨床腰椎間盤突出癥的保守治療提供依據。

資料和方法

一、資料

1.實驗動物：SPF級成年日本大耳兔9只(南昌龍平兔業有限公司，中國)，雌雄不限，平均體質量2 kg。實驗在深圳中洪博遠生物技術有限公司進行并完成。動物實驗方案經徐州醫科大學附屬醫院動物實驗倫理委員會審查通過。

2.試劑和儀器：DMEM/F-12培養基、胎牛血清、Opti-ME培養基、減血清培養基和Lipofectamine 3000試劑(Gbico公司，美國)；Trizon試劑(總RNA提取)、超純RNA提取試劑盒(ultrapure RNA)、HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture(康為世紀公司，中國)；蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)不含酚紅(Invitrogen公司，美國)；熒光聚合酶鏈反應儀(上海伯樂生命醫學產品有限公司，中國)；低溫高速離心機(常州中捷實驗儀器制造有限公司，中國)；NovoCyteTM流式細胞儀(杭州艾森生物有限公司，中國)；細胞周期染色試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，中國)；旋渦混合器(常州越新儀器制造有限公司，中國)；單道可調移液器(上海寶予德科學儀器有限公司，中國)；CO2培養箱(上海皓莊儀器有限公司，中國)；三目倒置顯微鏡(上海領成生物科技有限公司，中國)。

二、方法

1.髓核細胞的獲取、鑒定和分組：9只兔經耳緣靜脈注射空氣處死，于70%乙醇溶液中浸泡3 min。沿兔背部脊柱正中線剪開皮膚，分離并剝開椎旁肌，取出脊柱。仔細剝離椎體周圍所附著的肌肉及軟組織，以尖刀輕輕切開纖維環，暴露髓核組織。以眼科鑷小心夾取膠凍樣髓核組織，以眼科鑷及組織剪去除殘留的纖維環和終板，將髓核組織剪成1 mm×1 mm×1 mm大小碎塊。將剪碎的髓核組織置入0.1%Ⅱ型膠原酶液中37 ℃消化15～20 min，期間用吸管輕輕吹打，待大部分組織被消化、培養液渾濁后，用100目不銹鋼網進行過濾。懸液1 000 r/min，離心8 min，混懸計數細胞，以(1×105)/ml接種到6孔培養板和培養皿中。生長培養液為DMEM/F-12，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。于倒置顯微鏡下觀察細胞形態。第6天進行第1次換液，以后每隔3 d換液1次，記錄融合至90%的時間。待細胞融合至90%后以0.25%胰蛋白酶液消化并傳代。髓核細胞爬片后行HE染色和甲苯胺藍染色鑒定。將生長良好的髓核細胞制成細胞懸液。將所獲得的每只兔髓核細胞分為5組進行培養：對照組(常氧濃度下培養6 h)、低氧6 h組(2% O2濃度下培養6 h)、低氧12 h組(2% O2濃度下培養12 h)、低氧24 h組(2% O2濃度下培養24 h)和低氧48 h組(2% O2濃度下培養48 h)。

2.各組髓核細胞凋亡率檢測：取生長良好的兔髓核細胞，以1 ml 磷酸鹽緩沖液沖洗每個孔2次，并置入200 μl含乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)的胰蛋白酶液中進行消化，制備細胞懸液。將所得細胞懸液以2 500 r/min 離心3 min，棄上清液。加入磷酸鹽緩沖液1 ml，以2 500 r/min再次離心3 min，棄上清液。每管各加入磷酸鹽緩沖液300 μl，混勻。每管各加入Annexin V-FITC 雙標記試劑5 μl 和 胰蛋白酶抑制劑5μl，輕微混勻，室溫下避光孵育10 min后以流式細胞儀進行檢測。在流式細胞儀上，通過FITC通道檢測Annexin V-FITC雙標記髓核細胞(Ex=488 nm；Em=530 nm)，通過PE通道檢測胰蛋白酶抑制劑。

3.各組髓核細胞中HIF-1α、ASIC3及AQP3 mRNA表達水平檢測：采用實時聚合酶鏈反應法(real-time PCR,RT-PCR)。以Trizol法提取各組細胞中總RNA。取總 RNA 1μg進行逆轉錄。以 GAPDH 為內參設計引物：HIF-1α上游為5'-TTTGATTTTACCCATCCGTG-3'，下游為5'-CTTCCAGGTGGCAGACTTTA-3'；ASIC3 上游為5'-GAGCAGAAGAAGGCTTACGAA-3'，下游為5'-TAGAGGCGAGTGACGAGGT-3'；AQP3上游為5'-TGGCTACGCTGTCAACCCT-3'，下游為5'-ACGAAGACGCCCGCAAT-3'。對通過逆轉錄合成的cDNA 1 μl 進行 RT-PCR 擴增。反應條件為 95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，55 ℃～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，40 個循環。反應完畢后進行產物溶解曲線分析以判斷反應的特異性，并通過2-ΔΔCt 得到目的基因的相對表達量。

結 果

一、兔髓核細胞的鑒定

兔髓核細胞HE染色效果良好，組織結構清晰，細胞核內染色質與胞質內核糖體呈紫藍色，細胞質和細胞外基質中的成分呈紅色(圖1，2)。甲苯胺藍染色效果良好，組織結構清晰，軟骨細胞呈深藍色(圖3，4)。

圖1 顯微鏡下見兔髓核細胞(HE，×40)

圖2 顯微鏡下見兔髓核細胞(HE，×100)

圖3 顯微鏡下見兔髓核細胞(甲苯胺藍，×40) 圖4 顯微鏡下見兔髓核細胞(甲苯胺藍，×100)

二、各組兔髓核細胞凋亡率的比較

與對照組比較，低氧各組髓核細胞凋亡率均明顯升高，差異均有統計學意義(均P<0.01)；與低氧12、24和48 h組比較，低氧6 h組細胞凋亡率最高，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見圖5。

圖5 各組兔髓核細胞凋亡率比較 A 對照組 B 低氧6 h組 C 低氧12 h組 D 低氧24 h組 E 低氧48 h組

三、各組兔髓核細胞HIF-1α、ASIC3 和AQP3 mRNA表達水平的比較

與對照組比較，低氧各組HIF-1α、ASIC3 mRNA表達水平均明顯上升，差異均有統計學意義(均P<0.01)；與低氧12、24和48 h組比較，低氧6 h組HIF-1α、ASIC3 mRNA表達水平最高，差異均有統計學意義(均P<0.01)。與對照組比較，低氧各組AQP3 mRNA表達水平均明顯下降，差異均有統計學意義(均P<0.01)。見表1。

表1 各組兔髓核細胞HIF-1α、ASIC3 和AQP3 mRNA表達水平的比較

討 論

腰椎間盤突出組織自發性吸收是指腰椎間盤突出組織未經消融或手術治療等措施自發縮小甚至完全吸收的現象。關于其機制目前尚不明了，得到相對公認的機制包括炎性細胞的吞噬作用、突出組織血管化、免疫反應、金屬基質蛋白酶和組織金屬蛋白酶抑制劑的作用等[8-10]。文獻報道細胞凋亡也可能在其中起重要作用[11]。然而，是否存在一個可以促進腰椎盤突出組織自發性吸收進程的微環境？目前仍未知。本研究在不同時效的低氧環境下培養兔髓核細胞，觀察細胞凋亡情況，檢測細胞HIF-1α、ASIC3和AQP3 mRNA表達水平，從而探討缺氧環境對腰椎間盤突出組織自發性吸收的影響及其可能的作用機制。

椎間盤的微環境以低氧為特征，椎間盤細胞通過限制氧的消耗來適應局部缺氧環境。其中HIF-1α是缺氧時調節細胞能量代謝和存活能力的關鍵調節因子[12]。Ha等[13]發現破裂的椎間盤組織中HIF-1α的含量較未破裂椎間盤組織顯著升高，認為HIF-1α在椎間盤自發性吸收中起重要作用。但是截至目前為止，對HIF-1α與細胞凋亡間的關系仍未完全闡明。Zeng等[14]研究發現HIF-1α可誘導大鼠髓核細胞半乳糖凝集素-3的表達，從而抑制由凋亡相關因子介導的細胞凋亡進程，因此認為HIF-1α可能有抑制髓核細胞凋亡的作用。但也有學者提出與之相反的觀點，通過實驗發現嚴重缺氧及高表達的HIF-1α可能促使髓核細胞凋亡，認為通過HIF-1α的高表達來促使部分細胞凋亡有助于在不利環境下維持椎間盤的內穩態[11-15]。本研究在不同時效低氧環境下培養兔髓核細胞，與對照組相比其凋亡率均明顯升高，表明低氧環境下可以促進細胞凋亡，且以低氧培養6 h時細胞凋亡最為明顯。此時伴隨的HIF-1α mRNA高表達，可能與低氧環境下細胞凋亡密切相關，在后續研究中可通過加入其特異性阻斷劑來進一步揭示其內在聯系。

髓核為無血管的組織，被包裹在纖維環內，可被認為是一個特異性抗原。隨著纖維環撕裂，髓核組織突出，將導致機體自身免疫反應，從而引起一系列炎性反應。組織學研究結果顯示突出的髓核組織內有大量新生血管長入，存在巨噬細胞、淋巴細胞和肥大細胞等炎性細胞浸潤[16-18]，從而促進了椎間盤自發性吸收的進程。因此炎癥水平的高低與突出的髓核組織自發性吸收密切相關。有研究結果表明，激活ASIC3可促進多種炎性因子如TNF-α和IL-6的表達[19]，同時HIF-1α與缺氧狀態下機體眾多炎性因子表達、免疫反應的各種應答機制密切相關[20]。本研究發現低氧各組細胞ASIC3 mRNA表達水平均明顯高于對照組，以低氧6 h組最為顯著，同時ASIC3 mRNA表達水平與HIF-1α mRNA表達水平呈同步狀態。ASIC3和HIF-1α mRNA表達水平上調使局部炎性反應加強，通過炎性細胞的吞噬作用促進突出髓核組織自發性吸收。HIF-1α和ASIC3之間是否存在協同促進作用有待進一步研究。

AQP 是一種膜主體內在蛋白，可以介導自由水分子的跨生物膜轉運[21]。在形態學上，細胞凋亡的特點之一是水流失和體積縮小。高勵斌等[22]研究發現通過抑制AQP3的表達可降低細胞自噬水平從而促進細胞凋亡。本研究發現低氧環境下髓核細胞AQP3 mRNA表達水平較對照組明顯下降，與細胞凋亡率呈負反饋關系，提示AQP3可能也參與了髓核細胞凋亡的過程，這一結果與文獻報道一致。

綜上所述，短時間的低氧環境可以促進髓核細胞凋亡，其機制可能與HIF-1α和ASIC3 mRNA表達增加及AQP3 mRNA表達降低有關。