光譜重構油菜葉綠素含量快速檢測方法及設備研制

翁海勇，黃俊昆，萬 亮，葉大鵬*

1. 福建農林大學機電工程學院，福建 福州 350002 2. 浙江大學生物系統工程與食品科學學院，浙江 杭州 310058

引 言

葉綠素是植物最重要的色素之一，是判斷植物健康狀態的重要指標[1]。當植物遭受生物和非生物脅迫時，葉片中的葉綠素含量會隨之改變。因此，葉片中葉綠素含量的快速檢測對植物健康狀態的診斷具有重大的現實意義。傳統上，葉綠素含量的測量主要采用紫外分光光度法，雖然結果準確可靠，但是操作繁瑣，屬于離線測量，結果滯后，并且產生一系列化學廢棄液，污染環境，無法滿足現代農業對植物健康狀態精準高效監測的需求。

光學技術因其無損、快速、高效等優點在作物生理狀態監測中具有重要的應用前景。有學者根據葉綠素對不同波長的光的吸收率不同的原理開發了手持式相對葉綠素測量儀[2]和絕對葉綠素檢測儀[3-5]。上述設備成本低廉，操作方便，但是屬于單點測量，不同測量點之間數據波動性較大，也無法反映葉綠素在整個葉片分布的情況，并且檢測的結果也會受到葉片厚度和類型變化的影響。張建等[6]利用普通單反相機搭載濾波片的方式拍攝了水稻葉片的可見光和近紅外圖像，實現了葉片SPAD的測量。雖然SPAD值與葉綠素濃度存在較好的相關性，但對于不同類型的植物葉片，其SPAD值與葉綠素濃度之間的關系模型卻不盡相同[7]。由于光譜成像技術同時獲取了光譜信息和圖像信息，能夠實現植物生理狀態和養分分布的可視化表達。石吉勇等[8]應用高光譜成像提取了整個葉片的平均光譜并建立遺傳偏最小二乘葉綠素校正模型，實現了葉綠素在黃瓜葉片表面的分布，為黃瓜的長勢狀態提供了有效的參考信息。甘海明等[9]結合高光譜成像技術和深度學習實現了龍眼葉片葉綠素含量的預測，為龍眼的生長狀況及養分分布提供理論依據。Feng等[10]利用高光譜成像技術實現不同生長期水稻葉片葉綠素含量的快速檢測，實現了水稻生長狀況的快速診斷。Shi等[11]獲取了黃瓜葉片的近紅外高光譜圖像，結合多元線性回歸模型實現了葉綠素含量的快速檢測。與非成像的手持式葉綠素檢測儀相比，上述成像設備雖然能夠準確地獲取到葉綠素濃度及其在葉片空間的分布情況，但是儀器設備成本高，體積大，無法被大面積推廣使用。

鑒于上述情況，有必要開發一款體積小、成本低廉、操作簡便、結果可靠且能夠使葉綠素含量在整個葉片可視化表達的手持式設備。因此，以油菜為研究對象，采用自主研發的手持式多光譜成像系統采集油菜葉片的多光譜圖像，融合光譜重構技術，提高光譜分辨率，以期提高模型對葉綠素含量的反演能力，從而為油菜的生理狀態以及養分的精準化管理提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 油菜葉片采集

油菜來源于浙江省杭州市西湖區浙江大學紫荊港校區西區試驗田。油菜品種為浙大630，物候期為苗期。試驗田分成三個試驗小區，每個小區地塊面積為6.4 m×24.4 m，三塊小區的氮肥(尿素)施肥量分別為75, 150和225 kg·ha-1，磷肥(過磷酸鈣)和鉀肥(氯化鉀)的施用量均分別為60和150 kg·ha-1。尿素在12月中旬和來年2月份中旬施肥，磷酸鈣和氯化鉀則在油菜種植前施一次。為了使試驗數據分布范圍盡可能大，在采樣過程中分別從每個小區內采集100片(共300片)不同葉綠素含量的油菜葉片作為研究對象。

1.2 多光譜和高光譜圖像采集

為了實現油菜葉片葉綠素的快速無損精準檢測，本文開發了便攜式多光譜成像系統，用于油菜葉片多光譜圖像的采集。該設備主要包含了分辨率為480×640 pixels的單色黑白CMOS相機(MT9V032, ON Semiconductor, Phoenix, Arizona, USA)，光源LED(Epileds Technologies, Inc, Taiwan, China)、鏡頭(M0814-MP, CBC Corporation, Tokyo, Japan)和上位機軟件[圖1(a)]。在繪制電路板時，每個波長的LED安裝3個，間隔為120°[圖1(b)]。六個波段LED的中心波長分別為460，520，660，740，840和940 nm，半帶寬均為25 nm[圖1(c)]。上位機軟件依次觸發不同波長LED的驅動電路，從而依次點亮對應波長的LED，此時相機采集對應波段的光譜圖像，構成多光譜圖像立方塊[圖1(d)]。為了實現光譜重構，提高光譜分辨率，本試驗選取了室內高光譜成像系統作為參考儀器[圖1(e)]。高光譜成像系統主要由分辨率為672×512 pixels的CCD相機(C8484-05, Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan)、線光源(Fiber-Lite DC950, Dolan Jenner Industries Inc., Boxborough, MA)、波長范圍為379～1 023 nm、分辨率為2.8 nm的光譜儀(ImSpector V10E, Spectral Imaging Ltd., Oulu, Finland)、電控移動平臺、暗箱和電腦。為了使樣品的多光譜和高光譜圖像一一對應，利用打孔器從葉片上取下面積為50 cm2的圓盤葉片用于光譜圖像采集，并將整個葉片圓盤作為感興趣區域(region of interest, ROI)，用于提取平均光譜。多光譜圖像的采集參數為物鏡距離30 cm，曝光時間為35 ms，高光譜圖像的采集參數則為物鏡距離30 cm，曝光時間為30 ms，平臺移動速度為1.0 mm·s-1。在油菜葉片的高光譜和多光譜圖像采集前，首先獲取參考板和暗電流的光譜圖像數據，用于數據處理前原始光譜圖像的校正，以減少光照不均勻和暗電流對光譜圖像的影響，校正公式為

圖1 手持式多光譜成像系統(a)、不同波長LED的布局(b)、各個LED的中心波長(c)、 上位機軟件(d)及室內高光譜成像系統(e)

(1)

式中，R為校正后的光譜圖像，Idark為暗電流圖像，Iraw為原始光譜圖像，Iref為參考板光譜圖像。

1.3 葉綠素含量測定

在光學圖像采集后，采用傳統方法測量葉片中葉綠素含量[12]。將上述50 cm2的圓盤葉片浸泡在裝有8 mL 95%乙醇的離心管中。黑暗環境中靜置24 h后，使用酶標儀 (Epoch2, BioTek Instruments, Inc, Vermont, USA)測量葉綠素溶液在470，649和665 nm的吸光度值(A470，A649和A665)，用于計算出葉片中葉綠素的濃度。

1.4 光譜重構

光譜重構技術是將目標物低維的光譜值恢復高維的光譜值，達到提高分辨率和檢測精度的目的。采用偽逆法求解轉換矩陣實現多光譜向高光譜重構，轉換矩陣的求解過程如式(2)—式(4)[13]

Xms=XssF

(2)

(3)

Xss,c=Xss,uF

(4)

1.5 預測模型的建立與評價

2 結果與討論

2.1 光譜反射率分析

應用室內高光譜成像系統和手持式多光譜成像系統所測得所有油菜葉片的平均光譜反射率曲線如圖2(a)和(b)所示。分析圖2(a)和(b)可知，兩臺儀器測得油菜葉片平均反射率的絕對值不同； 原因可能由于兩者的傳感器響應(室內高光譜成像系統用的是CCD，而手持式多光譜成像設備用的是CMOS)存在差異引起的。然而進一步分析可知，兩臺設備測得的葉片的平均光譜曲線趨勢一致，表現為因葉綠素和類胡蘿卜素吸收引起的在藍光(460 nm)和紅光(660 nm)區域出現的波谷，葉片反射綠光在520 nm引起的綠色反射峰。因“紅邊”效應引起的在660～740 nm波長范圍內的反射率急劇上升。由于植物對近紅外光幾乎不吸收，導致近紅外區域(740～940 nm)的反射率較高。圖2(c)顯示了重構的和室內高光譜成像系統所測的所有樣品在430～1 023 nm內的高光譜反射率。分析圖2(c)可知，重構的油菜高光譜反射率和室內高光譜成像系統所測的高光譜反射率基本上處于相同的數值區間。對比分析可見光(430～740 nm)和近紅外(740～1 023 nm)區域的重構效果可以看出，重構的光譜反射率與室內系統獲得的光譜反射率在可見光區域的重疊度高于近紅外。這可能是由于相機傳感器在可見光范圍內的量子效率優于近紅外。圖2(d)顯示了所有樣本重構的光譜反射率和室內高光譜成像系統測得的光譜反射率兩者之間的相關性系數(r)均可達到0.99以上，說明了偽逆法能夠實現多光譜向高光譜的重構。

2.2 校正模型的預測性能分析

2.3 光譜重構的效果評價

圖2 室內高光譜成像系統獲得的所有油菜葉片的平均光譜反射率(a)，手持式多光譜成像系統測得的所有油菜葉片的平均光譜反射率(b)，重構的高光譜反射率和室內高光譜成像系統測得的葉片高光譜反射率(c)，重構的光譜反射率和室內高光譜成像系統測得的葉片光譜反射率之間的相關性系數(d)

圖3 基于室內高光譜成像系統獲得的可見光范圍內225個波段光譜反射率(a)和手持式多光譜成像系統獲得的可見光范圍內4個波段光譜反射率建立的葉綠素PLSR模型的預測性能

圖4 不同標樣集個數對PLSR模型預測性能的影響(a)和標樣集為5時重構得到的光譜建立的PLSR模型的預測效果(b)

3 結 論