土壤原位酶譜技術研究現狀和趨勢的文獻計量分析

范利超，顏鵬，韓文炎

(中國農業科學院 茶葉研究所， 浙江 杭州 310008)

土壤原位酶譜技術(soil zymography)是一種新興的二維空間土壤酶活性可視化及定量化的技術，由于其無破壞且可重復測量的特征，近年來在農業和生態學領域得到了快速發展[1]。土壤原位酶譜技術是底物誘導型酶活性(substrate-dependent enzyme activity)的可視化技術，其原理是利用土壤中的活性酶氧化分解由熒光染料與相應底物合成的特定熒光底物，從而產生熒光信號在尼龍膜上顯影的過程[2]。合成的熒光底物最初位于膜上，被熒光底物浸泡飽和的尼龍膜與土壤表面緊密貼合后，合成的熒光底物在遇到土壤表面的特定酶時被分解，從而激活熒光[2]。土壤原位酶譜技術的結果是由在紫外燈下顯影并利用相機通過合適的設備設定后拍攝的二維圖像，被稱為原位酶譜(zymogram)[2]。原位酶譜圖像可以進一步定量為單位面積和單位時間的酶活性。Baldrian等[3]第一次嘗試進行了土壤酶活性的可視化，即將合成的熒光標記底物溶解在瓊脂糖溶液中，然后把溶液直接倒灑在土壤樣品表面而不是利用膜作為載體。Spohn等[1]第一次采用尼龍膜作為合成熒光標記底物的載體，應用于土壤表面實現了土壤酶活性的二維顯影。用于土壤酶譜的熒光染料底物有多種[2]，例如7-氨基-4-甲基香豆素(7-amino-4-methyl coumarin，AMC)和4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone，MUF)等。目前，土壤酶譜可視化的酶共有十種[2]，分別為α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)、β-纖維二糖苷酶(β-cellobiosidase)、木聚糖酶(xylanase)、磷酸酶(phosphatase)、亮氨酸氨基肽酶(leucine-aminopeptidase)、酪氨酸氨基肽酶(tyrosine-aminopeptidase)、幾丁質酶(chitinase)、殼三糖苷酶(chitotriosidase)和過氧化物酶(peroxidase)。

土壤原位酶譜技術被發展應用于農業和生態學的多個方面[4-5]：(1)在田間和實驗室條件下比較不同植物類型之間的酶活性分布特征。例如，Razavi等[6]比較了在氣候室根箱(rhizobox)種植條件下玉米(Zeamays)和扁豆(Lensculinaris)的土壤酶活性的空間分布，其結果表明扁豆根部的酶活性是均勻分布的，而玉米根尖處酶活性較高，從根尖向外酶活性逐漸降低直到相對穩定(圖1)。(2)環境因素對土壤酶活性的影響，例如溫度[7]、水分[8-9]、營養元素[10]和重金屬污染[11]等。(3)根形態對土壤酶活性的影響，例如根毛及根徑大小[12-13]。(4)土壤酶活性在不同土壤層面的差異，例如植物根際(rhizosphere)[14-15]、土壤生物孔洞(biopores)[16]和植物殘體形成的土孔環境(detritusphere)[17-18]。(5)鑒定植物根際范圍大小和土壤微生物活動的“熱點”區域[4,19]。但是，土壤原位酶譜技術反映的是土壤剖面或根箱表層土壤的酶活性而不是代表整個土體，因此，土壤原位酶譜技術并不能取代經典的酶活性測定方法[3]。

A和B分別為扁豆和玉米根箱土壤表層的酶譜，其中每個圖中a～d分別為亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶、β-葡萄糖苷酶及纖維二糖苷酶。C和D分別為扁豆和玉米植株根尖區域的酶活性變化特征，詳情分析可見參考文獻[6]。圖片使用已獲參考文獻[6]的作者授權。圖1 土壤原位酶譜的實例

文獻計量分析是一種基于數學統計的定量分析方法，該方法使用文獻來客觀有效地評估學科領域的研究熱點和研究趨勢[20-21]。當前，許多學者已經使用這種方法探索了農業、經濟、政治、 生態、管理等諸多學科研究的前沿和熱點[22-23]。為此，本研究擬基于Web of Science收錄數據，對當前土壤原位酶譜技術研究進行文獻計量分析，以期為相關研究提供參考。

1 數據來源與研究方法

本文用于文獻計量分析的數據來源于科睿唯安的 Web of Science核心合集數據庫(Core Collection)。以soil-zymography為文獻檢索的主題詞(TS)，則可以檢索出以學術術語“soil-zymography”為主題但排除其他zymography相關的論文。對所有年份 (All years) 和文獻類型為Article和Review的文獻進行檢索。本文文獻數據集的檢索時間為2020年4月18日。利用Web of Science 自帶的分析工具、VOSviewer[24]和HistCite軟件對土壤原位酶譜研究領域的發文數量和被引次數的變化趨勢、主要發文國家和機構以及作者之間的合作網絡關系、研究領域的學科分布、關鍵詞及研究熱點等進行分析。其中合并同義的關鍵詞，例如soil zymography與zymography，enzyme activity與enzyme activities等。

2 結果與分析

2.1 發文數量和被引次數

發文數量可反映該領域的發展速度和發展進程，可表征研究者對本領域的關注程度[22]。通過檢索，得到的土壤原位酶譜領域的文獻數量為29篇(圖2)。總文獻數量較低說明土壤原位酶譜技術仍然處于發展的前期階段。第一篇以“soil-zymography”為特定主題的文獻出現在2013年，從2013年至2018年，年發文數量相對平穩。2019年發文量為10篇，占總文獻集的34%。文獻被引次數逐年增加，總被引次數為572次，其中2019年的被引次數為222次，占總被引次數的39%。Spohn等[1]在2013年首次以“soil zymography”為題發文在SoilBiology&Biochemistry上，目前該篇論文的被引次數為50次。單篇文獻最高被引次數為85次，是Spohn等[14]于2013年發表在SoilBiology&Biochemistry上的另一篇論文。這些數據說明土壤原位酶譜技術經過幾年的發展和不斷完善，即將迎來快速發展的時期。

圖2 土壤原位酶譜技術相關文獻的發文數量和被引次數

2.2 論文來源國家/地區和研究機構

通過檢索，土壤原位酶譜技術相關論文的來源國家/地區共14個。從表1可以看出，德國的發文或參與發文數量和總被引次數高居首位，分別為24篇和436次。因為總發文數量為29篇，而德國發文量或參與發文量占83%，說明德國是土壤原位酶譜技術研究的主要參與國家。參與土壤原位酶譜技術研究領域的機構超過了40個，其中德國哥廷根大學參與發文量最多，發文數量為18篇，其次是俄羅斯土壤科學理化與生物問題研究所和德國基爾大學。中國科學院、中國科學院大學、成都理工大學及中國環境科學院為主要國內參與發文機構。如圖3所示，圓圈大小表示發文數量的多少，連線是表示不同研究機構間聯系的密切程度。德國哥廷根大學和基爾大學為土壤原位酶譜技術研究的中心，基本所有的發文機構均與這兩所大學有合作。其中哥廷根大學的農業土壤系及溫帶生態系統土壤系和基爾大學的土壤科學與植物營養系為主要研究實驗室。

圖3 土壤原位酶譜技術論文產出的主要研究機構之間的合作

表1 土壤原位酶譜技術研究發文的國家/地區

2.3 發文的國際刊物

由HistCite軟件分析結果(表2)可見，共有10種期刊刊載了土壤原位酶譜技術相關論文，其中發文量最多的期刊是SoilBiology&Biochemistry，占發文總量的 59%。其次為PlantandSoil和BiologyandFertilityofSoils，分別占發文量的10%和7%。土壤原位酶譜技術相關論文在SoilBiology&Biochemistry，總被引次數為350次；其次為PlantandSoil，總被引次數為59次。但是土壤原位酶譜技術相關論文的篇均被引頻次和五年影響因子最高的期刊為TrendsinPlantScience，篇均被引次數為48次，該期刊的五年影響因子為14.0。期刊SoilBiology&Biochemistry發表的土壤原位酶譜技術相關論文的篇均被引頻次為20.6次。期刊的學科類別有5種，分別為土壤科學(soil science)、植物科學(plant sciences)、農藝學(agronomy)、環境科學(environmental science)和毒理學(toxicology)。

表2 土壤原位酶譜技術研究領域發文的期刊

2.4 主要研究學者

通過HistCite軟件分析結果可見，參與土壤原位酶譜技術領域研究的學者目前共有79人。其中參與發文量大于2篇(包括2篇)的共有29人。如圖4所示，圓圈大小表示發文數量，連線是研究學者之間的相互合作關系。其中，Razavi B S發文數量最多為18篇，其次為Kuzyakov Y和Blagodatskaya E，分別參與發文數量為16和10篇。多數研究者均與以上3位研究者有合作關系。土壤原位酶譜相關論文的總被引次數最多的研究學者是Kuzyakov Y，為385次，其次為Razavi B S和Spohn M，總被用次數分別為218和213次，Blagodatskaya E的總被用次數為163次。

圖4 發文數量(≥2)的研究學者之間的合作關系

2.5 土壤原位酶譜技術的研究熱點

論文中關鍵詞可以簡要表達文章的主要研究內容，所以一個關鍵詞出現的頻率越大，說明相關的主題為主要研究熱點。在關鍵詞共線網絡中，與土壤原位酶譜技術(soil zymography)關系密切的有空間分布(spatial distribution)、根際(rhizosphere)、磷酸酶活性(phosphatase activity)、酶活性(enzyme activities)、熱點(hotspots)、微生物群落結構(microbial community structure)、微生物量(microbial biomass)、機制(mechanisms)、碳(carbon)等(圖5)。土壤原位酶譜技術不僅可以可視化多種酶活性的空間分布特征，還可以確定植物根際的區域大小，進而可以精確地從根際區域采集土壤進行土壤微生物量和微生物群落結構等的分析，為探索土壤-微生物-植物之間的相互作用機理提供了更好的途徑。目前可運用土壤原位酶譜技術可視化的酶共有10種，其中磷酸酶作為酶活性相關的關鍵詞出現的頻次較高，說明了對土壤磷素研究是目前土壤科學的一個研究熱點。

圖5 土壤原位酶譜技術研究論文中重要關鍵詞的共線網絡

3 小結與展望

本文利用Web of Science數據庫，對土壤原位酶譜領域的研究論文進行了文獻計量學分析。結果表明，在全球范圍內對土壤原位酶譜領域的研究越來越重視。土壤原位酶譜領域是土壤學科和植物學科的重要交叉領域，研究學者對土壤原位酶譜技術更廣泛的應用和重視對土壤學和植物學的發展起到了積極的推動作用。德國、俄羅斯、中國和美國的等國家在該領域發文較多，其中德國哥廷根大學和基爾大學為該領域研究的中心。不同機構的研究學者合作緊密，以Kuzyakov Y和Razavi B S為高頻次被引學者。土壤原位酶譜技術的主要發文期刊為SoilBiology&Biochemistry。土壤原位酶譜技術未來研究趨勢主要集中于根際。根際是土壤與植物連接的最為活躍的區域，土壤原位酶譜技術可以結合微生物高通量測序技術以及同位素示蹤技術，更好地促進對根際區域的微生物群落、根系分泌物代謝機理、土壤-植物互作(例如土傳病害)、碳氮磷等元素的利用效率、植物光合碳分配問題、重金屬對土壤根系和微生物的影響等方面的研究。但是，土壤原位酶譜技術在操作方式、應用環境、底物濃度選擇及后期圖像數值化處理等方面依然存在不足，有待進一步規范和優化。