清瘟敗毒顆粒中連翹苷的薄層色譜鑒別和含量測定試驗

趙玉叢， 李艷玲， 鄭瑞錦， 張遠方

(河南牧業經濟學院制藥工程學院， 河南鄭州450046)

清瘟敗毒散是《中華人民共和國獸藥典》(簡稱《中國獸藥典》)收載的成方制劑[1]，具有瀉火解毒、清熱涼血的功效，主治畜禽熱毒發斑、高熱神昏等，臨床上主要用于治療禽流行性感冒、傳染性胸膜肺炎、急性腹膜炎、病毒性腹瀉及不明原因的頑固性水瀉、腸毒綜合征、各種細菌及原蟲感染等引起的畜禽疑難雜癥等[2-5]。

清瘟敗毒顆粒是清瘟敗毒散的改劑型制劑，將清瘟敗毒散制成現代制劑顆粒劑，可克服散劑在臨床使用中吸收利用率低、見效慢、單位體重用量大等不足，同時在制備顆粒劑時所用的輔料蔗糖會起到矯味劑的作用，增加其適口性，有利于豬和其他大動物的臨床使用。目前《中國獸藥典》所收載的清瘟敗毒散的質量標準僅有顯微鑒別和黃連的薄層色譜(TLC)鑒別，無含量測定項，但散劑可用顯微鑒別各成分，顆粒劑由于不具備散劑的原始纖維或藥材結構特點，故不能使用顯微鑒別。《中國獸藥典》目前亦尚未收載清瘟敗毒顆粒。本課題組擬通過對清瘟敗毒顆粒中的指標成分進行TLC鑒別和含量測定的方式以建立其質量標準。連翹是清瘟敗毒顆粒中的重要藥味，其主要藥效成分連翹苷具有抗菌、抗病毒、強心、抗肝損傷等作用。連翹苷的含量測定方法文獻報道較多，有近紅外光譜(FT-NIR)法[6]、高效液相色譜(HPLC)法[7-9]、高效液相色譜-質譜聯用(HPLC-MS)法[10]、超高效液相色譜(UPLC)法[11]等，其中HPLC法獲得了廣泛的應用，但尚未見用HPLC法測定清瘟敗毒顆粒中連翹苷的含量的報道。本試驗選擇連翹苷作為清瘟敗毒顆粒劑的指標成分之一，建立了連翹苷的TLC鑒別方法和HPLC含量測定方法，并對連翹苷從連翹藥材到清瘟敗毒散、連翹藥材到清瘟敗毒顆粒中的轉移率進行對比研究，以期為清瘟敗毒顆粒劑制備工藝的優化和質量標準的建立提供依據。

1 材料

LabTech-LC18型液相色譜儀(北京萊伯泰科儀器有限公司) ； KQ-200KDE超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司) ； SHZ-96A型循環水式真空泵(鞏義市華予儀器有限責任公司) ； 分析天平(上海醫用激光儀器廠) ； AL-100A型多功能搖擺式粉碎機(上海賓潤電器有限責任公司)。

乙腈、甲醇均為色譜純(上海金太陽化學品有限公司) ； 冰醋酸、石油醚(30～60 ℃)、三氯甲烷等其他試劑均為分析純(湖北杜克化學科技有限公司)。連翹苷對照品，購自中國藥品生物制品檢定所； 清瘟敗毒顆粒和陰性樣品，河南牧業經濟學院制藥工程學院提供，陰性樣品不加連翹藥材 ； 連翹藥材，購自河南鄭州瑞龍國藥醫藥有限公司，經河南牧業經濟學院制藥工程學院趙建平高級獸醫師檢驗，符合2015版《中國獸藥典》(二部) 項下相關要求和規定。取連翹藥材約100 g，粉碎過5號篩。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定連翹苷對照品20.000 mg于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含2 mg的溶液，作為對照品貯備液。分別精密量取此貯備液適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取清瘟敗毒顆粒樣品15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加石油醚(30～60 ℃)20 mL密塞，超聲15 min，濾過，棄去石油醚液，加甲醇20 mL密塞，超聲20 min，濾過，濾液濃縮至1 mL，作為供試品溶液。

2.1.3 陰性對照液的制備 取缺連翹的清瘟敗毒顆粒(制藥工程學院自制)15 g，精密稱定，按供試品溶液的制備方法得陰性對照液。

2.1.4 連翹藥材對照溶液的制備 取連翹藥材粉末1 g精密稱定，按“2.1.2”項下方法，制得連翹藥材對照溶液。

2.2 連翹苷的TLC鑒別 吸取連翹陰性對照液、清瘟敗毒顆粒供試品溶液、連翹苷對照品溶液和連翹藥材對照液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(8∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，檢視，結果見中插彩版圖1。由圖1可知，供試品色譜中在與連翹對照藥材色譜和連翹苷對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，而陰性色譜沒有，表明本試驗建立的TLC法可以進行清瘟敗毒顆粒中連翹苷成分的定性鑒別。

2.3 連翹苷的HPLC含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：LabTech-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相∶水∶冰醋酸(27∶73∶0.1)；流速：1.0 mL/min；UA檢測波長：277 mm；柱溫：30 ℃； 進樣量：10 μL。

2.3.2 專屬性試驗 分別精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液、陰性對照液和連翹藥材對照溶液各10 μL，在2.3.1項色譜條件下進樣測定，記錄色譜圖，結果見圖2、3、4、5。結果顯示，供試品中連翹苷與對照品色譜峰保留時間一致(保留時間為14.638 min)，與其他共存成分的分離度良好(>1.5)，且陰性樣品在相應位置無色譜峰干擾，表明清瘟敗毒顆粒中其他成分對連翹苷的測定無干擾。

2.3.3 線性關系考察 精密吸取各濃度連翹苷對照品溶液10 μL分別進樣，按2.3.1項色譜條件測定，記錄峰面積(A)為縱坐標，以連翹苷濃度(C)為橫坐標，進行線性回歸，得連翹苷的回歸方程：A=6 810 842.36C+17 742.88(r=0.999 9)。線性結果表明，連翹苷的濃度在0.025～0.8 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.3.4 精密度試驗 通過測定連翹苷對照品的日內、日間精密度可以進行精密度的評價，分別選取連翹苷對照品高、中、低3個不同濃度(分別為0.4、0.2 mg/mL和0.05 mg/mL)，日內精密度的考查為在同一天內每個濃度重復測定6次，日間精密度則是在連續3 d每天每個濃度重復測定2次，并計算相對標準偏差(RSD)，評價方法的重現性。結果顯示，連翹苷的日內精密度RSD和日間精密度RSD分別小于0.9%和1.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.5 回收率試驗 精密稱取清瘟敗毒顆粒9份，每份15 g，分別加入高、中、低3個濃度的連翹苷對照品溶液，每個濃度3份，按2.1.2項方法制備溶液，在2.3.1項色譜條件下分別進樣10 μL進行測定，計算回收率和RSD(見表1)，得連翹苷的平均回收率在96.4%～103.2%，RSD范圍為1.0%～4.5%。

圖2 連翹苷對照品色譜圖Fig. 2 Chromatogram of Forsythin reference substance 1:連翹苷； 下圖同1:Forsythin. The same as below figures

圖3 供試品色譜圖Fig. 3 Chromatogram of test sample

圖4 陰性對照色譜圖Fig. 4 Chromatogram of negative control

圖5 連翹藥材對照色譜圖Fig. 5 Control chromatogram of Forsythia suspense

表1 回收率試驗結果Table 1 Recovery test results

2.3.6 樣品含量測定 分別取連翹藥材以及由同一批藥材制得的清瘟敗毒顆粒樣品和清瘟敗毒散樣品(均為自制，15 g顆粒劑和散劑分別相當于1 g連翹藥材)各3 批，按2.1.2項方法制備樣品溶液，在2.3.1項色譜條件下依次測定，結果見表2。從表中數據可以看出，連翹苷在連翹藥材中的含量為1.526 5 mg/g，在清瘟敗毒顆粒樣品中的含量為0.720 1 mg/15 g，連翹苷從藥材到顆粒劑的轉移率為47.2%；連翹苷在清瘟敗毒散樣品中的含量為0.721 9 mg/15 g，連翹苷從藥材到散劑的轉移率為47.3%。兩者之間的轉移率并無明顯差異。

表2 樣品測定結果Table 2 Sample determination results (n=3)

3 討論

3.1 方法的選擇 本試驗分別選擇了TLC法和HPLC法進行清瘟敗毒顆粒中連翹苷的鑒別和含量測定，結果表明，本試驗所建立的TLC鑒別方法專屬性強，HPLC含量測定方法在專屬性強的前提下，精密度及線性關系較好，回收率亦較為滿意，可用于清瘟敗毒顆粒中指標成分連翹苷的質量控制。

3.2 流動相的選擇 根據文獻報道，HPLC法測定制劑中連翹苷含量的方法主要采用乙腈-水流動相系統[7-9],本試驗參照以上方法多次調整溶劑系統中乙腈和水的比例，最后確定乙腈-水比例為27∶73，該比例下連翹苷色譜峰保留時間14.638 min，與制劑中其他成分的色譜峰分離良好，鑒于色譜峰出現拖尾現象，又添加適量的冰醋酸調整流動相的pH，使其峰形有所改善，最終確定流動相為乙腈∶水∶冰醋酸(27∶73∶0.1)系統。

3.3 連翹苷提取工藝的優化 在2015版《中華人民共和國藥典》中，連翹苷的提取需經過氧化鋁柱[7]，但中性氧化鋁在去除雜質的同時，連翹苷也因吸附而造成損失，本試驗在保證連翹苷與制劑中其他成分完全分離的基礎上，選擇不過氧化鋁柱，可減少連翹苷提取過程中的損失，精簡提取步驟，提高分析效率；提取溶劑的考察，比較了水、乙酸乙酯、甲醇等不同溶劑提取后得到的色譜峰峰面積，確定甲醇為最佳提取溶劑；提取方式比較了超聲提取、加熱回流和靜置過夜這3種常用的提取方法，試驗結果顯示，超聲提取法優于其他2種方法；超聲提取時間比較了超聲處理10、20、30 min和40 min的差別，結果表明，超聲提取20 min后，連翹苷的含量基本恒定。本試驗最終確定連翹苷的提取工藝為先用石油醚脫脂，然后用甲醇超聲提取20 min，該方法制備得到的供試品可同時滿足連翹苷的TLC鑒別和HPLC含量測定。

本試驗結果表明，由同一批藥材制得的顆粒劑與散劑中連翹苷的含量無明顯差別，說明單就指標成分連翹苷來看，從化學成分上清瘟敗毒顆粒替代傳統散劑應用可行。但中藥制劑的質量不能單以一個或幾個指標成分來進行評價，研究清瘟敗毒顆粒在臨床上替代傳統散劑的可行性，還需結合藥理藥效、藥代動力學參數和臨床效果等進一步的研究。

連翹苷從藥材到散劑及從藥材到顆粒劑的轉移率均偏低，一方面是因為散劑一般為粗粉直接入藥，細胞破壁率極低，同時因為藥物粒粗,位于粒子內部的有效成分需穿過幾個或數十個細胞壁及細胞膜方可釋放出來，造成釋放速度很慢；而連翹苷從藥材到顆粒劑的轉移率低，表明清瘟敗毒顆粒劑的生產工藝需進一步改進。