丁香酚對維氏氣單胞菌抑菌作用的研究

劉忠卓， 單曉楓， 靳勝男， 田佳鑫， 張 偉， 康元環， 錢愛東

(1. 吉林農業大學動物科學技術學院， 吉林長春130118 ； 2. 吉林省圖們市動物疾病預防控制中心， 吉林圖們133100)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬氣單胞菌科，氣單胞菌屬，是一種重要的人-獸-水生動物共患病原菌。該菌廣泛存在于自然界水域及土壤當中，其中部分菌株致病能力較強，可引起魚類等水生動物皮膚潰爛、臟器出血及腹腔積液等，嚴重時可造成大量死亡 ； 同時該菌還可感染人類，導致人類胃腸炎和菌血癥等疾病[1]。近年來，有關維氏氣單胞菌感染所引起的水產動物疾病頻繁暴發，給水產養殖業造成了經濟損失，但因養殖業者對抗生素藥物的不合理應用，促使該致病菌產生了多重耐藥性[2]； 此外，由于抗生素在養殖環境中不易消除，其不僅給水產品的質量安全帶來隱患，而且還嚴重破壞生態環境。因此，尋求一種能替代抗生素且有效、安全的漁用藥物對于水產養殖業至關重要。在替代抗生素的備選漁藥中，中草藥及其提取物顯示出獨特的優勢，其具有抗病菌、抗病毒及改善水產品質量等作用，并具不易產生耐藥性、環保及能提高水產動物免疫力等優點[3]，越來越受到人們的關注，而從中草藥中研制與開發新型的漁用藥物也成為了水產防治疾病的一個新方向。

丁香酚(Eugenol)是丁香、月桂、樟腦等許多藥用植物揮發油的主要成分，其是一種有機酚，常溫下為微黃色的油狀液體，在空氣中易揮發且伴有強烈丁香氣味，微溶于水，易溶于乙醇、二甲基亞砜(DMSO)等有機溶劑[4]。研究表明，丁香酚不但具有廣譜的抑菌活性和殺菌活性，而且還具有一定的鎮靜麻醉、抗炎及抗氧化等功效[5]； 同時，由于其毒副作用小、不易殘留等特點，有學者認為其有望成為一種新型的天然抑菌劑。通過體外試驗發現，丁香酚對多種致病菌株均有一定抑制作用，如鰻弧菌(Vibrioanguillarum)[6]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)[7]、金黃色葡萄球(Staphylococcusaureus)[8]等，但目前關于丁香酚對維氏氣單胞菌抑菌作用的研究鮮有報道。本試驗以維氏氣單胞菌為供試菌，通過研究丁香酚對維氏氣單胞菌的抑菌作用，以及丁香酚在低濃度下對該菌株生物被膜形成能力、運動性、脂肪酶活性及蛋白酶活性的影響來探討丁香酚的抑菌機理，以期為丁香酚用于防治水產養殖細菌疾病提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 維氏氣單胞菌TH0426株(分離于患病的黃顙魚體內)，由吉林農業大學預防獸醫學研究室保存。

1.2 主要試劑與儀器 丁香酚(純度≥99%)，購自上海麥克林生化科技有限公司；偶氮酪蛋白，購自美國Sigma-Aldrich公司；三氯乙酸、氫氧化鈉，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DMSO、Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)、PBS、吐溫80、氯霉素溶液、結晶紫，均購自北京索萊寶科技有限公司；低溫高速離心機，購自德國Sigma公司；全波長酶標儀，購自美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌液制備 將本實驗室凍干保存的維氏氣單胞菌接種至LB液體培養基中進行活化，采用無菌接種環蘸取活化后的菌液劃線于RS固體平板中，28 ℃溫箱中過夜培養；挑取板上生長的單菌落接種至含液體LB的10 mL試管中，28 ℃，180 r/min搖床中培養12 h后，采用平板菌落計數法計算菌液濃度，并將其梯度稀釋至1×106～1×109CFU/mL，于4 ℃中保存備用。

1.3.2 抑菌活性的測定 抑菌活性的測定參考文獻[6]所述方法并略作改進。稱取6.4 mg丁香酚溶于DMSO中，并用LB液體培養基配置成質量濃度為6 400 μg/mL的母液以備用，后續試驗所需系列濃度均以此母液稀釋配置所得。吸取200 μL濃度為1×108CFU/mL的菌液均勻涂布于固體LB平板中，用無菌的牛津杯在平板上打3個孔再對其封底。待底部凝固后，向1號孔中加入150 μL丁香酚母溶液，2號孔中加入150 μL的1% DMSO溶液為溶劑對照，為比較分析丁香酚與維氏氣單胞菌敏感性抗生素的抑菌差異性[9]，向3號孔中加入150 μL質量濃度為200 μg/mL的氯霉素溶液為對比試驗，隨后將平板置于28 ℃溫箱中培養24 h。待培養結束后，利用游標卡尺測量抑菌圈直徑并記錄數據。每次試驗設置3組重復，試驗重復3次。抑菌效果參照文獻[10]中的標準判定，即抑菌圈直徑>20 mm為極度敏感；15～20 mm為高度敏感；10～15 mm為中度敏感；<10 mm為低度敏感。

1.3.3 最低抑菌濃度(MIC)的測定 根據微量二倍稀釋法[11]檢測丁香酚對維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度。預先于96孔培養板中加入100 μL濃度為1×106CFU/mL的菌液，試驗組加入100 μL丁香酚使其每孔的終濃度依次為3 200、1 600、800、400、200、100、50 μg/mL和25 μg/mL，空白對照組加入100 μL不含丁香酚的LB液體培養基，溶劑組則加入100 μL 的1% DMSO，每組均設3個重復孔，充分混勻，置于28 ℃溫箱中培養24 h，利用全波長酶標儀測定OD600值從而確定丁香酚的MIC值。試驗重復3次。

1.3.4 最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用瓊脂擴散法測定丁香酚對維氏氣單胞菌的最小殺菌濃度。從上述96孔板培養的菌懸液中各取100 μL培養物，接種至無菌的LB平板上，28 ℃溫箱培養24 h，待培養結束后根據各平板中細菌的生長情況以判定 MBC值。

1.3.5 生長曲線的測定 吸取濃度為1×108CFU/mL的菌液，將其按1%比例接種至含丁香酚(終濃度分別為800、400、200、100、50 μg/mL和25 μg/mL)的LB培養基中；同時設置培養基內不添加丁香酚的空白對照組與添加等量1% DMSO的溶劑組，28 ℃、180 r/min搖床中震蕩培養24 h，期間每隔2 h取樣1次，利用酶標儀測定其在OD600值并記錄，以細菌培養的時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制生長曲線圖。試驗重復3次。

1.3.6 生物被膜形成能力的測定 參照Tan等[12]所用的96孔板法檢測菌株生物被膜形成能力并適當改進，具體操作如下：將濃度為1×109CFU/mL的菌液按1%比例接種至含丁香酚(終濃度依次為200、100、50、25、12.5 μg/mL)的LB液體培養基中，同時設置空白對照組及1% DMSO的溶劑組，充分混勻并吸取200 μL的混合液于無菌的96孔培養板中，每組均設3個重復孔，置于28 ℃溫箱中培養24 h。待培養結束后，吸凈孔中的液體，用無菌的PBS緩慢清洗3次后，置于溫箱中晾干；待晾干后，每孔加入200 μL的甲醇溶液固定20 min，吸棄甲醇，室溫晾干15 min；待干燥后，每孔加入1%結晶紫染液200 μL，染色30 min，棄去染液，用無菌雙蒸水清洗3次，每孔200 μL，吸棄雙蒸水后，輕甩培養板至其干燥。待完全干燥后，向各孔中加入200 μL的33%冰醋酸溶液并充分混勻，靜置10 min后用酶標儀測定其OD575值，以判定菌株的生物被膜形成能力。試驗重復3次。

1.3.7 運動性的測定 參考文獻[13]所述方法并略微調整，高壓滅菌含0.3%瓊脂的LB培養基，待培養基冷卻至50 ℃后，試驗組加入丁香酚使其終濃度分別為200、100、50、25、12.5 μg/mL和6.25 μg/mL，溶劑組加入等量的1% DMSO，空白對照組則為不含丁香酚的LB培養基，輕輕搖勻并倒入相同規格的平板，試驗中為排除培養基體積所產生的誤差，需將培養基在試管中配置(20 mL/管)。待培養基凝固以后，分別吸取2 μL濃度為1×107CFU/mL的菌液接種至培養基表面，28 ℃溫箱培養24 h，培養期間平板勿晃動，待培養結束后測量各菌落直徑，菌落直徑大小與細菌運動能力呈正相關。試驗中每個濃度設3個重復，試驗重復3次。

1.3.8 脂肪酶活性的測定 根據Yang等[14]所述方法，檢測丁香酚對維氏氣單胞菌脂肪酶活性的影響。高壓滅菌含1.5%瓊脂和含1%吐溫80的LB培養基，待其冷卻至50 ℃后，試驗組加入丁香酚(藥物濃度同1.3.7)，溶劑組加入等量的1% DMSO，同時設置空白對照組，輕輕混勻后并倒入平板。待凝固后，吸取2 μL濃度為1×107CFU/mL的菌液接種至平板正中央，28 ℃溫箱靜置培養48 h，待培養結束后分別測量各組中菌落直徑和其外圈沉淀環直徑，外圈沉淀環直徑與菌落直徑的比值即為脂肪酶活性的大小。試驗中每個濃度設3個重復，試驗重復3次。

1.3.9 蛋白酶活性的測定 蛋白酶活性的檢測結合文獻[15]的方法并稍作改進。吸取濃度為1×107CFU/mL的菌液按1%比例接種至含丁香酚(終濃度依次為200、100、50、25、12.5 μg/mL和6.25 μg/mL) 的LB液體培養基中；同時設置空白對照組及1% DMSO的溶劑組，28 ℃，180 r/min搖床中培養36 h后收集培養物。將培養物于4 ℃，12 000 r/min 離心30 min，吸取上清液，并經0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌以獲得胞外產物。分別吸取150 μL上述不同組的產物于2 mL的無菌EP管中，向管中加入1 mL的0.3%偶氮酪蛋白溶液，而后用旋渦振蕩器混勻再置于37 ℃水浴鍋中培養30 min，待培養結束后立即向管中加入10%的三氯乙酸溶液500 μL以終止反應，室溫下靜置10 min 后，于4 ℃下離心10 min，吸取上清液100 μL轉接到96孔板中(每組均設3個重復孔)，最后向各孔中加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液100 μL，于酶標儀中震蕩10 s后讀取其OD400值。試驗重復3次。

1.4 數據統計 本試驗所得數據利用軟件SPSS Statistics 20進行統計分析，最終結果以“平均值±標準差”方式表示，并使用單因素方差分析和Duncan新復極差法在P=0.05水平上進行顯著性檢驗。

2 結果

2.1 丁香酚對維氏氣單胞菌的抑菌活性 抑菌活性的試驗結果如中插彩版圖1所示，當丁香酚質量濃度為6.4 mg/mL時，其抑菌圈的直徑為(20.32±0.8) mm(1號孔，極度敏感)；1% DMSO溶液無抑菌圈產生(2號孔，不敏感)，這也表明以DMSO溶液作為丁香酚的助溶劑對其抑菌效果無影響；對照組氯霉素溶液的抑菌圈直徑為(30.85±0.78)mm(3號孔，極度敏感)。

2.2 丁香酚對維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度(MIC) 由酶標儀檢測溶劑組(DMSO)和空白對照組(Contol)的OD值無顯著差異(P>0.05)可知，溶劑組的菌體生長狀態和空白對照組基本無差別，因此，可忽略丁香酚的助溶劑(1% DMSO)對維氏氣單胞菌生長的影響。當丁香酚濃度大于400 μg/mL時，28 ℃下培養24 h后，孔中培養液仍澄清透明，即維氏氣單胞菌沒有生長，因此，丁香酚對維氏氣單胞菌的MIC為400 μg/mL(圖2)。

圖2 丁香酚對維氏氣單胞菌的最低抑菌濃度Fig.2 Minimum inhibitory concentration of eugenol against Aeromonas veronii注：不同小寫字母表示組間差異顯著，P<0.05；下圖同Note:Different lowercase letters mean significant difference among groups,P<0.05. The same as below

2.3 丁香酚對維氏氣單胞菌的最小殺菌濃度(MBC) 通過最小殺菌濃度試驗發現，當丁香酚濃度為800 μg/mL時，維氏氣單胞菌在平板中不生長，而丁香酚濃度為400 μg/mL時，其在板中生長狀態良好。根據《食品中抗菌藥物殘留的化學分析》[16]，以無菌落生長的最低藥物濃度為最小殺菌濃度(MBC)，因此丁香酚對維氏氣單胞菌的MBC為800 μg/mL。

2.4 不同濃度的丁香酚對維氏氣單胞菌生長曲線的影響 生長曲線的測定結果顯示，溶劑組(DMSO)與空白對照組(Contol)生長曲線基本重合，二者在生長能力上無顯著差異(P>0.05)。當丁香酚濃度小于50 μg/mL，其對維氏氣單胞菌的生長無顯著影響(P>0.05)，此時菌株的生長趨勢同空白對照組，它們具有相似的遲緩期、對數期及穩定期；丁香酚濃度大于100 μg/mL時，其顯著抑制了維氏氣單胞菌的生長(P<0.05)，此時菌株的生長速率較空白組而言相對減緩，且在穩定期時的OD值明顯下降；丁香酚濃度大于800 μg/mL時，維氏氣單胞菌不生長(見中插彩版圖3)。

2.5 丁香酚對維氏氣單胞菌生物被膜形成能力的影響 結合酶標儀所測OD575值，對菌株生物被膜形成量比較分析發現，當丁香酚濃度大于100 μg/mL時，其顯著抑制了維氏氣單胞菌生物被膜的形成(P<0.05)；丁香酚濃度小于50 μg/mL時，其顯著促進了維氏氣單胞菌生物被膜形成(P<0.05)，且丁香酚濃度越低，促進作用越明顯(圖4)。

圖4 丁香酚對維氏氣單胞菌生物被膜形成的影響Fig.4 Effects of eugenol on biofilm formation of Aeromonas veronii

2.6 丁香酚對維氏氣單胞菌運動性的影響 在運動性試驗中，通過測量菌落直徑可得知，當丁香酚濃度大于25 μg/mL時，其顯著抑制了維氏氣單胞菌的運動性(P<0.05)，且丁香酚濃度越高，抑制作用越顯著；丁香酚濃度小于12.5 μg/mL時，其對維氏氣單胞菌的運動性無顯著影響(P>0.05，圖5)。

圖5 丁香酚對維氏氣單胞菌運動性的影響Fig.5 Effects of eugenol on the motility of Aeromonas veronii

2.7 丁香酚對維氏氣單胞菌脂肪酶活性的影響 利用含1%吐溫80的LB板對脂肪酶活性進行檢測時發現，當丁香酚濃度為200 μg/mL時，其顯著抑制了維氏氣單胞菌的脂肪酶活性(P<0.05)；丁香酚濃度小于100 μg/mL時，其對維氏氣單胞菌的脂肪酶活性無顯著影響(P>0.05，圖6)。

2.8 丁香酚對維氏氣單胞菌蛋白酶活性的影響 蛋白酶活性的檢測結果顯示，不同濃度的丁香酚均可顯著性地抑制維氏氣單胞菌的蛋白酶活性(P<0.05)，當丁香酚濃度為200 μg/mL時，其對維氏氣單胞菌蛋白酶活性的抑制作用最明顯(圖7)。

圖6 丁香酚對維氏氣單胞菌脂肪酶活性的影響Fig.6 Effects of eugenol on the lipase activity of Aeromonas veronii

圖7 丁香酚對維氏氣單胞菌蛋白酶活性的影響Fig.7 Effects of eugenol on the protease activity of Aeromonas veronii

3 討論

隨著水產養殖環境的不斷惡化，水產養殖病害愈發嚴重，因此大量的抗生素類藥物被廣泛用于防治水產致病菌。然而，抗生素類藥物在初次使用時效果極佳，但隨著普遍地用藥以及藥量的加大會致使病原菌產生耐藥性；此外由于抗生素在環境中可持久殘留，其還給水產品及水體質量造成影響，因此，尋找一種安全無毒且不易產生耐藥的抗菌藥物以治療水產病原菌具有重要意義。近年來，中草藥及其提取物被用于水產動物病害防治的報道不斷出現，并且作為后抗生素的使用逐漸得以替代，因此頗受研究學者的重視。丁香酚作為一種天然無污染的植物提取物，因其抑菌效果好、安全性高、綠色環保等優勢而備受關注。

本試驗通過丁香酚對維氏氣單胞菌的抑菌試驗發現，當丁香酚質量濃度為6.4 mg/mL時，維氏氣單胞菌對丁香酚表現為極度敏感，即該濃度的丁香酚對該致病菌具有良好的抑菌作用。MIC及MBC試驗結果表明，丁香酚對維氏氣單胞菌TH0426株的MIC值為400 μg/mL、MBC值為800 μg/mL，而Bandeira等[11]研究發現，丁香酚對銀魚源維氏氣單菌的MIC和MBC分別為800 μg/mL和1 600 μg/mL，其與本試驗結果不相同，因此我們認為丁香酚對于不同來源菌株的抑菌效果也會有所不同。生長曲線的測定結果顯示，丁香酚對維氏氣單胞菌的生長有抑制作用，而且其對菌株的抑制作用呈現出濃度依賴性，當丁香酚濃度大于100 μg/mL時，菌株生長相對緩慢，并且其遲緩期的時間相對延長，這說明丁香酚有效地抑制了維氏氣單胞菌的生長。現有研究表明，丁香酚通過作用于細菌細胞內的酶活性或功能蛋白，影響細胞代謝，從而抑制細菌生長[8]；還有研究認為丁香酚通過破壞細菌的細胞膜而達到抑菌效果[17]，鑒于目前有關丁香酚抑菌機理的說法尚未統一，所以其作用機理還有待進一步探究。

研究表明，維氏氣單胞菌的致病性強弱與其分泌、表達的多種毒力因子密切相關，如外毒素、粘附因子(菌毛、鞭毛)、胞外產物(脂肪酶、蛋白酶)等[18]，而細菌在侵襲、感染宿主的過程中往往需要多種毒力因子相互協同發揮致病作用。鑒于高濃度的抑菌藥物對細菌耐藥的選擇壓力大[19]，因此，本試驗開展了低濃度的丁香酚對維氏氣單胞菌生物被膜形成能力、運動性、脂肪酶活性及蛋白酶活性等毒力作用的試驗，擬通過丁香酚干擾維氏氣單胞菌致病能力，從而起到防控該致病菌感染的目的。生物被膜是細菌在繁殖過程中，免受抗菌藥物及宿主免疫應答反應的一種保護形式。通過測定菌株的生物被膜時發現，當丁香酚濃度大于100 μg/mL 時，其能有效地抑制維氏氣單胞菌生物被膜的形成，而丁香酚濃度小于50 μg/mL時，其能有效促進菌株生物被膜的形成，而我們認為丁香酚是通過抑制菌株的生長，進而抑制其生物被膜的形成；前期通過測定生長曲線時發現，當丁香酚濃度小于50 μg/mL時，其對菌株的生長無影響，所以該濃度范圍內，丁香酚對其生物被膜并不產生抑制作用，但其是如何刺激菌株生物被膜的形成，具體機制尚未清楚，仍需進一步研究。運動性試驗結果表明，丁香酚濃度大于25 μg/mL時，其能有效地降低維氏氣單胞菌的運動能力，通過文獻得知[18]鞭毛可介導氣單胞菌的運動能力，所以猜測丁香酚可能是破壞了菌株的鞭毛結構從而導致其運動能力大幅降低。胞外產物是病原菌的重要致病因子，其通過降解宿主的蛋白質、多糖、脂質等引起宿主組織損傷，從而利于病原菌入侵宿主體內發揮致病作用。通過丁香酚作用于維氏氣單胞菌的脂肪酶和蛋白酶的試驗，結果發現其脂肪酶和蛋白酶的活性均有降低，與空白對照組相比，尤其是蛋白酶活性有顯著差異。綜上所述，我們初步預判丁香酚作用機理是其通過影響細菌中的粘附因子、胞外產物等一些毒力因子，從而起到抑菌作用。

綜合本試驗結果可知，丁香酚對維氏氣單胞菌具有一定的抑菌和殺菌效果，而且低濃度的丁香酚對該菌株的部分毒力因子具有抑制作用，但其抑制作用有限；然而考慮到藥物在發揮抑菌作用時，不是單純地作用于病原菌，其對水產動物本身也具有一定影響，所以恰當的藥物濃度對于防控細菌的感染至關重要，而低濃度的丁香酚能否用于防治水產維氏氣單胞菌，仍需應用于實際生產中以驗證效果。本試驗所得結果，可供丁香酚在漁業生產上的應用提供參考，并為丁香酚在漁業生產中制定給藥方案、合理用藥提供一定理論依據。