五倍子與抗菌藥聯(lián)合用藥對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的作用研究

王 婧，雷春娟， 濮鑫怡， 徐 澤， 陳海峰

(1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院， 江蘇泰州225300 ； 2. 中國動物疫病預(yù)防控制中心， 北京朝陽100126)

大腸埃希菌作為人和動物腸道內(nèi)的正常菌群，在特定條件下，該菌的某些血清型可導(dǎo)致人和動物發(fā)病[1]，表現(xiàn)為敗血病、卵黃性腹膜炎和慢性呼吸道病等[2]。在獸醫(yī)臨床，主要引起如仔豬黃白痢、豬水腫病、禽大腸桿菌病等常見病、多發(fā)病[3]，每年我國由大腸埃希菌造成的畜禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失可達數(shù)10億元。近年來細菌的耐藥性問題日趨嚴重，腸桿菌科細菌中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended spectrum beta-lactamases，ESBLs)比例不斷增加，使得革蘭陰性菌耐藥率逐年上升，呈世界性流行趨勢。尋找新型抗菌藥物成為人們關(guān)注和研究的焦點。五倍子為漆樹科植物鹽膚木、青麩楊或紅敷楊葉上的蟲癭，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，五倍子的藥理活性主要包括殺精、抗細菌、抗氧化活性[4-5]和抗齲齒作用[6]，有研究表明，五倍子提取物對唾液中的浮游細菌、水產(chǎn)生物常見致病菌等均具有明顯的抑菌活性[7-8]。為進一步探究五倍子水提物與抗菌藥聯(lián)合使用對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的抑制作用，本試驗對臨床分離菌株的ESBLs基因型進行了鑒定，并采用微量棋盤稀釋法測定五倍子水提物與抗菌藥聯(lián)用后的部分抑菌濃度指數(shù)，判定抗菌效果是否發(fā)生明顯改變，對臨床上防治此類細菌感染具有重要意義，為五倍子在臨床的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 本試驗所使用菌株分離于腹瀉仔豬的肛拭子樣本，由本實驗室分離、鑒定保存。氨曲南(30 μg/片)、頭孢他啶(30 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、頭孢他啶/棒酸(30 μg/片)、頭孢噻肟/棒酸(30 μg/片)、慶大霉素(30 μg/片)，均購自杭州濱河微生物試劑有限公司；MH、LB等培養(yǎng)基，均購自杭州百思生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑，均購自TaKaRa公司；硫酸慶大霉素、阿莫西林、環(huán)丙沙星、氟苯尼考，均購自阿拉丁生化科技股份有限公司；頭孢噻呋鈉、鹽酸左氧氟沙星，均購自江蘇南通飛宇生物科技有限公司，且純度均高于98.5%。

1.2 產(chǎn)ESBLs菌株的檢測與驗證 按照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)推薦的ESBLs標準紙片擴散法進行操作。對實驗室保存的81株大腸埃希菌活化后進行氨曲南、頭孢他啶等的藥敏試驗，試驗結(jié)束后測定抑菌圈并進行記錄。若抑菌圈滿足下列任一條件即為疑似產(chǎn)ESBLs菌株：氨曲南(30 μg/片) ≤27 mm、頭孢他啶(30 μg /片) ≤22 mm、頭孢曲松(30 μg /片) ≤25 mm、頭孢噻肟(30 μg /片) ≤27 mm。

進一步采用以下藥敏紙片進行產(chǎn)ESBLs確證，若采用頭孢他啶(30 μg /片)、頭孢他啶/棒酸(30/10 μg /片)、頭孢噻肟(30 μg /片)、頭孢噻肟/棒酸(30/10 μg /片)復(fù)合藥敏紙片進行試驗，當任何一種復(fù)合劑紙片抑菌圈直徑大于或等于其單獨藥敏紙片抑菌圈直徑5 mm，可認為其攜帶產(chǎn)ESBLs耐藥基因。

1.3 產(chǎn)ESBLs基因型的檢測

1.3.1 引物合成 引物參照GenBank登錄的大腸桿菌基因序列，根據(jù)參考文獻[9-11]分別設(shè)計了SHV、OXA、CTX-M-25引物，見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 產(chǎn)ESBLs基因引物序列Table 1 The primer sequences of ESBLs-producing genes

1.3.2 PCR擴增 采用煮沸法制備菌株DNA模板，配置25 μL PCR擴增體系：模板DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，PremixTaq酶 12.5 μL，去離子水9.5 μL。PCR擴增參數(shù)如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s， 60 ℃(SHV)45 s，55 ℃(OXA)45 s，56 ℃(CTX-M-25)45 s；72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增條帶大小與目的條帶一致的PCR產(chǎn)物送生物公司進行序列測定，并利用BLAST進行基因?qū)Ρ确治觥?/p>

1.4 藥物的制備與稀釋 將五倍子藥材敲碎，除去蟲癭，粉碎后過60目篩，稱取100 g五倍子粉末，加入10倍量的80%丙酮，充分攪拌后置于45 ℃水浴鍋中保溫浸提3 h，過濾保存濾液，同樣方法再次提取，合并2次濾液后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適當體積后，冷凍干燥成粉末即得，共獲得74.2 g，產(chǎn)率為74.2%。臨用前稱取適當五倍子提取物，加入水將其溶解至4 096 μg/mL備用。

1.5 五倍子提取物及抗生素的單藥最低抑菌濃度(MIC)測定 最低抑菌濃度采用微量稀釋法測定五倍子對產(chǎn)ESBLs菌的MIC，具體操作如下：擴增好的菌液用MH肉湯調(diào)整至含菌量約為1×106CFU/mL備用。在96孔板每孔加入100 μL MH肉湯培養(yǎng)基，在A1孔加入100 μL 藥液使終濃度為1 024 μg/mL，對A1～A10孔進行倍比稀釋，棄掉第A10孔多余的液體，然后每孔加入菌液100 μL，重復(fù)3次。每行第11、12孔以不加藥物或不加菌液分別作為陽性和陰性對照，于37 ℃培養(yǎng)14～18 h后觀察結(jié)果，以不生長細菌孔最低藥物濃度為MIC濃度。

1.6 與西藥的棋盤試驗 采用微量方陣棋盤法測定五倍子提取物及各抗菌藥聯(lián)合使用的抗菌效果。將藥物用MH培養(yǎng)基在滅菌離心管中倍比稀釋為32～4 096 μg/mL，取五倍子藥液50 μL由高濃度至低濃度加入96孔板的第1～8列，取另一種抗生素50 μL由高到低依次加入96孔板的A～H行，每孔再加入100 μL調(diào)整好濃度的菌液，第9、10列分別作為陰性和陽性對照，微量振蕩器震蕩使藥液混勻，37 ℃下培養(yǎng)14～18 h，觀察五倍子提取物與抗菌藥聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs菌的抑制作用，試驗重復(fù)3次。

根據(jù)抑菌結(jié)果計算聯(lián)合抑菌濃度指數(shù)(Fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)。FICI=(MIC五倍子聯(lián)合/MIC五倍子)+(MIC抗菌藥聯(lián)合/MIC抗菌藥)，結(jié)果的判斷依據(jù)是：FICI≤0.5為協(xié)同作用，F(xiàn)ICI>4為拮抗作用，0.5

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌的篩選 按照CLSI的標準，對本實驗室保存的81株臨床分離的大腸埃希菌進行產(chǎn)ESBLs篩選，對菌株進行初篩之后參照1.2的方法進行確證，最終81株大腸埃希菌中鑒定得到26株產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌，檢出率為32.1%。

2.2 產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌基因型的確定 對上述鑒定為產(chǎn)ESBLs的大腸埃希菌進行基因型的確定。PCR結(jié)果顯示，26株產(chǎn)ESBLs菌中SHV陽性4株，OXA陽性9株，CTX-M-25陽性10株，其中有2株菌對這3種基因型檢測結(jié)果均為陽性，電泳結(jié)果見圖1。

2.3 五倍子提取物與抗菌藥單獨作用于產(chǎn)ESBLs菌的MIC 根據(jù)上述產(chǎn)ESBLs鑒定以及基因型鑒定結(jié)果，后續(xù)MIC試驗針對3個ESBLs基因陽性的2株菌進行，分別是TZ3-1、TZ8-2。五倍子提取物與抗菌藥單獨作用于2株產(chǎn)ESBLs菌的MIC值分別見表2和表3。從表中可看出，硫酸慶大霉素和頭孢噻呋鈉對TZ3-1、TZ8-2兩株菌的MIC值均高于1 024 μg/mL， 鹽酸左氧氟沙星對這2株菌的抑菌效果最佳，MIC分別為16 μg/mL和32 μg/mL。五倍子提取物對這2株菌MIC值分別達到32 μg/mL和64 μg/mL，表明其對產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌具有較好的抑制作用。

圖1 3種基因型陽性的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of three positive genotypesM:Marker;1:OXA;2:CTX-M-25;3:SHV

2.4 五倍子聯(lián)合抗生素的抗菌作用 五倍子聯(lián)合抗生素對產(chǎn)ESBLs菌TZ3-1株的抗菌作用見表2，對TZ8-2的聯(lián)合抑菌作用見表3。從表中可看出，五倍子與硫酸慶大霉素和環(huán)丙沙星聯(lián)用對2株產(chǎn)ESBLs菌均呈協(xié)同作用；與頭孢噻呋鈉聯(lián)用僅對TZ3-1表現(xiàn)為協(xié)同作用，但對TZ8-2的FICI值仍然較低，可能也表現(xiàn)為協(xié)同作用；五倍子與阿莫西林、鹽酸左氧氟沙星、氟苯尼考聯(lián)用表現(xiàn)為無關(guān)作用。

表2 五倍子聯(lián)合抗生素對TZ3-1的抗菌作用結(jié)果Table 2 The antibacterial effect of Galla chinensis combined with antibiotics on TZ3-1 isolate

表3 五倍子聯(lián)合抗生素對TZ8-2的抗菌作用結(jié)果Table 3 The antibacterial effect of Galla chinensis combined with antibiotics on TZ8-2 isolate

3 討論

β-內(nèi)酰胺酶有多種分類，與臨床關(guān)系密切的有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)，頭孢菌素酶(Amp cephalosporinase，Amp C)和碳青霉烯酶等。這些酶的基因既可以存在于細菌的染色體內(nèi)，也可以存在于質(zhì)粒當中，并且可協(xié)同氨基糖苷類、磺胺類和氟喹諾酮類耐藥基因隨質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)移，在臨床分離株中廣泛傳播。到目前為止，全世界一共發(fā)現(xiàn)了超過200種ESBLs，根據(jù)其編碼基因的同源性，可將ESBLs分為TEM型、SHV型、CTX-M型、OXA型和其他型[13]，近年來CTX-M型已發(fā)展成為全球人醫(yī)和獸醫(yī)臨床最流行的ESBLs型。在國內(nèi)近10年期間報道的雞源、食品源或其他動物源性ESBLs大腸埃希菌中CTX-M型的檢出率更是高達80%以上。德國、羅馬尼亞等也均報道雞源腸桿菌中ESBLs檢出率高達60%～81%[14]。本試驗中產(chǎn)ESBLs菌檢出率為32.1%，且主要以CTX-M基因型為主，產(chǎn)ESBLs檢出率比劉雅妮等[15]2011年報道的從上海地區(qū)分離的豬源大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs檢出率有所上升，而與近兩年報道的河南[16]、貴州[17]等地的豬源大腸埃希菌ESBLs相比檢出率低。

天然產(chǎn)物資源豐富，含有多種活性成分，在抗感染方面發(fā)揮獨特的作用。許多研究表明，五倍子具有良好的抗菌作用[18-19]，五倍子與抗生素聯(lián)合抑制作用鮮有報道，為了更加全面的了解五倍子的藥理作用，本試驗通過微量棋盤試驗研究了五倍子與常用獸用抗生素的聯(lián)合抑菌作用進行了測定。結(jié)果顯示，五倍子與硫酸慶大霉素和頭孢噻呋鈉聯(lián)用對產(chǎn)ESBLs菌具有協(xié)同抑制作用，與環(huán)丙沙星聯(lián)用時表現(xiàn)為協(xié)同或相加作用。本試驗結(jié)果雖然五倍子和阿莫西林、鹽酸左氧氟沙星和氟苯尼考聯(lián)合使用時表現(xiàn)為無關(guān)作用，但是從聯(lián)合使用后的MIC值可以看出較單獨使用有明顯的降低。由此可見，若五倍子與抗菌藥聯(lián)用可大大減少抗菌藥物臨床使用量，表明五倍子具有較好的開發(fā)應(yīng)用價值。