犬細小病毒可視化LAMP檢測方法的建立與應用

潘 珺， 程敏姮， 張啟龍， 張 瑋， 吳 迪，宋彥軍， 劉曉冬， 周德剛， 王 林， 韋海濤

(北京市動物疫病預防控制中心， 北京大興102629)

犬細小病毒病是由犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)引起的犬的一種具有高度接觸性傳染的烈性傳染病。犬細小病毒為無囊膜的單鏈DNA病毒結構，基因組全長為5 323 bp，含有2個主要的開放閱讀框(Open reading frames,ORFs)ORF1和ORF2，編碼的蛋白包括非結構蛋白NS1、NS2和結構蛋白VP1、VP2[1]。自CPV流行以來，由于VP2基因不斷變異，產生多種變異毒株，致使該病毒在國內外廣泛流行[2]。不同年齡階段的犬均可以感染CPV，對2～4月齡的幼犬危害最大，死亡率高達70%以上。臨床以感染性腹瀉癥狀、急性出血性胃腸炎、急性心肌炎和高死亡率為特征[3]，對養犬業造成巨大的危害，因此臨床上急需一種能夠快速檢測CPV的方法。本試驗建立并提供了一種具有高靈敏度、高特異性、高準確度、熒光可視化的檢測犬細小病毒LAMP檢測方法，用于犬細小病毒核酸的快速、精確地檢測。

1 材料與方法

1.1 病毒株 犬細小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬瘟熱病毒(Canine distemper virus,CDV)、犬冠狀病毒病(Canine coronavirus,CCV)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)、犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)，均由北京市動物疫病預防控制中心實驗室保存。

1.2 臨床樣品 犬健康血液(經常見疫病試劑盒檢測為陰性的樣本)和200份臨床樣品采自北京市5家寵物醫院。

1.3 主要試劑 LAMP所用DNA擴增試劑盒、熒光目視檢測試劑,均購自榮研生物科技(中國)有限公司；磁珠法核酸提取試劑，購自哈爾濱元亨生物藥業有限公司；犬細小病毒通用型實時熒光PCR檢測試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；cDNA反轉錄試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 儀器 Loopamp?實時濁度測定儀器(LA-320C),購自榮研生物科技(中國)有限公司；熒光定量PCR儀ABI Quant Studio 7,購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；TGuide S32全自動核酸提取純化儀,購自天根生化科技有限公司；MA1610型等溫熒光PCR儀,購自北京蘭伯瑞生物技術有限公司。

1.5 引物和探針的設計合成 通過對GenBank已發表的50個不同犬細小病毒全基因的數據比對分析，得到1段高度保守的VP2基因序列(參考序列GenBank:M19296.1)，運用在線生物軟件(http://primerexplorer.jp/)，設計適用于LAMP的特異性引物組兩組，包括基礎引物(F3、B3、FIP、BIP)和環引物(LB)。引物由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成，引物信息見表1。

表1 LAMP檢測CPV所用引物Table 1 LAMP primers for CPV detection

1.6 CPV質粒的構建 通過對GenBank中收錄的CPVVP2基因序列進行比對分析，設計合成含有CPV 1 754 bp的質粒，質粒由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。

1.7 病毒DNA的制備 按照病毒DNA提取試劑盒(磁珠法)說明書提取CPV毒株和健康犬血液中的DNA；取CDV、CCV、RV、CIV等毒株，按照試劑盒說明書提取總RNA，反轉錄成cDNA獲得DNA；所有DNA模板于-20 ℃保存，待用。

1.8 LAMP方法的建立及優化 反應體系：2×反應緩沖液12.5 μL、Bst DNA聚合酶溶液1 μL、5 μmol/L的F3 1 μL、5 μmol/L的B3 1 μL、40 μmol/L的FIP 1 μL、 40 μmol/L的內引物BIP 1 μL、20 μmol/L的環引物LB 1 μL、ddH2O 0.5 μL、熒光目視檢測試劑1 μL，DNA模板5 μL，總體積25 μL。反應程序:63 ℃， 60 min。以CPV、CDV、CCV及犬健康血液核酸為模板，分別用兩組LAMP引物進行擴增，篩選最佳引物組。以CPV DNA為模板，采用上述篩選出的引物組，設置61 ℃、63 ℃、65 ℃、67 ℃ 4個溫度，在Loopamp儀上進行擴增，篩選最佳反應溫度。

1.9 特異性試驗 以CPV、CDV、CCV、RV、CIV等毒株核酸為模板，以滅菌雙蒸水為陰性對照，采用1.8中的體系及篩選出的引物組和最佳溫度于等溫熒光PCR儀擴增反應，驗證LAMP方法的特異性。結果的判定方法為：(1)陽性對照：60 min內呈現綠色；(2)陰性對照：60 min內呈現橘黃色。待測樣本結果判定：(1)陽性：60 min內呈現綠色；(2)陰性：60 min內呈現橘黃色。

1.10 敏感性試驗 將合成的CPV質粒經微量核酸蛋白檢測儀測定，將質粒濃度稀釋至1×104拷貝/μL，然后按10倍倍比稀釋，獲得1×104、1×103、1×102、10、1 拷貝/μL和0.1 拷貝/μL等濃度梯度，分別進行LAMP和Real-time PCR擴增，檢測LAMP靈敏度并與Real-time PCR進行對比分析。Real-time PCR擴增按照犬細小病毒通用型實時熒光PCR檢測試劑盒使用說明書進行操作。反應體系：無菌無核酸酶水 5.9 μL，PCR反應液 10 μL，熒光探針2.1 μL，DNA 2 μL，總體積20 μL。反應程序：95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，循環數為40。

1.11 臨床樣品檢測 采集臨床200份樣品，按照磁珠法核酸提取方法進行核酸提取。應用所建立的LAMP檢測方法和實時熒光定量PCR同時檢測該200份臨床樣品，計算2種檢測結果的符合率。

2 結果

2.1 最佳引物組的確定 以CPV、CDV、CCV及犬健康血液提取的核酸為模板，對設計的兩組引物進行篩選，結果顯示，引物組A在26 min時檢出CPV陽性樣本核酸(見中插彩版圖1A中的編號1)，CDV、CCV及犬健康血液在2 h內均未檢出(見中插彩版圖1A中的編號2～4)。引物組B在47 min 時檢出CPV陽性樣本核酸(見中插彩版圖1B中的編號1)，CDV、CCV及犬健康血液在2 h內均未檢出(見中插彩版圖1B中的編號2～4)。結果表明，本試驗的引物組A具有較高的擴增效率和特異性。

2.2 最佳溫度的確定 選擇A組引物在Loopamp儀上進行擴增，經不同溫度試驗后，由反應速率圖可見在63 ℃下，反應啟動時間最早、速率峰值最高(見中插彩版圖2)，故反應最佳溫度定為63 ℃。

2.3 特異性試驗 用所建立的可視化LAMP方法分別檢測CPV、CDV、CCV、RV、CIV和健康犬血液提取的基因組，結果僅CPV檢測管中呈現綠色，其他管均呈現橘黃色(見中插彩版圖3)。表明本試驗建立的可視化LAMP方法具有良好的特異性。

2.4 敏感性試驗 將濃度為104拷貝/μL DNA模板10倍倍比稀釋，分別進行LAMP和Real-time PCR擴增。結果顯示，LAMP方法的檢出下限為10 拷貝/μL (見中插彩版圖4)，Real-time PCR的檢出下限也為10 拷貝/μL(見中插彩版圖5)，表明本試驗建立的可視化LAMP方法敏感性高，與Real-time PCR檢測靈敏度一致。

2.5 LAMP可視化檢測方法的應用 用所建立的可視化LAMP方法和Real-time PCR同時對200份臨床樣品進行檢測，結果顯示，所建立的LAMP方法檢出陽性21份，且與熒光定量PCR方法檢測結果一致，符合率為100%(見表2)。

表2 可視化LAMP與熒光定量PCR方法對臨床樣品的檢測Table 2 Detection of clinical samples with visual LAMP and Real-time PCR

3 討論

目前LAMP技術已在醫療衛生、食品檢測、環境檢測及動物疫病病原檢測方面等領域有著廣泛應用[4-7]。本試驗將熒光目視檢測劑添加至LAMP擴增反應體系中，在保證不影響擴增反應的前提下，獲得了更簡便、更直觀、更客觀的結果判定方法，且不需要昂貴復雜的儀器，只需一個水浴鍋或金屬浴即可。

對于LAMP 反應的結果判定，目前主要有瓊脂糖凝膠電泳檢測、實時濁度檢測和染料指示劑法。瓊脂糖凝膠電泳檢測需要開蓋檢測易造成實驗室氣溶膠污染，實時濁度法檢測使反應在密閉的條件下進行，有效避免氣溶膠污染以及染料對反應的抑制[8]，故本試驗在篩選引物和反應條件時選用了實時濁度檢測。為了更好的臨床快速檢測，本試驗在最后的結果判定時選取了鈣黃綠素染料法，利用鈣黃綠素可與Mn2+在試劑中結合呈棕黃色的淬滅態，LAMP反應后Mn2+與反應副產物焦磷酸根結合釋放鈣黃綠素，使其解除淬滅態自然光下變為綠色[9]，使反應更加直觀和簡便。

Rebecca P W等[10]建立的隔熱式恒溫PCR(Insulated isothermal PCR，iiPCR)檢測方法的最低檢測限為13拷貝。 Liu L B等[11]建立可視化LFS RPA檢測方法在37 ℃中恒溫反應15 min，且在5 min內即可肉眼看到擴增產物，其最低檢測限為100拷貝。Sun Y L等[12]建立的免疫捕獲LAMP方法(Immunocapture-LAMP,IC-LAMP)需要復雜的集成電路，其酶聯免疫吸附(IC-LAMP-ELISA)和側流試紙(IC-LAMP-LFD)2種檢測技術的靈敏度均為10-1TCID50/mL，但需1.5 h才能完成CPV的診斷過程。姜一瞳[13]建立的側流層析試紙條(LFD)-RPA檢測方法的最低檢測限為10 拷貝/μL，其陽性檢出率為88%。而本試驗建立的可視化LAMP檢測方法的最低檢測限為10 拷貝/μL，在63 ℃下恒溫反應60 min 即可，且可肉眼直接觀察結果，檢出率為100%。靈敏度與Real-time PCR檢測技術一致，與Rebecca P W和Liu L B等建立的方法相比靈敏度較高，與姜一瞳建立的方法相比陽性檢出率更高，與Sun Y L等建立的方法相比，所需時間更短，但是比Liu L B等所需時間更長，所需溫度更高。綜上所述，本試驗建立的可視化LAMP檢測方法具有集高靈敏度、高特異性、高準確度、高效便捷、低成本于一體的優勢，即可用于臨床樣品中病毒的檢測，也可用于動物飼料、飲水等環境中的病毒檢測，尤其適用于疫情應急、野外檢測及基層防疫，對犬細小病毒病的及時診療和有效防控具有重要意義。