河北省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒3型分子流行病學(xué)調(diào)查及遺傳變異分析

王會(huì)杰， 仇國(guó)明， 軒秋燕， 馬貴達(dá)， 顧文源， 王金鳳，劉立兵， 王建昌， 張若曦， 韓慶安

(1.河北省生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)秦皇島綜合實(shí)驗(yàn)站 秦皇島市畜牧工作站， 河北秦皇島066000 ；2.河北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心， 河北石家莊050035 ； 3.石家莊海關(guān)技術(shù)中心， 河北石家莊050051)

豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)屬于圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)成員[2]，基因組為單股環(huán)狀DNA，是迄今發(fā)現(xiàn)最小的動(dòng)物病毒[1]。PCV包含PCV1和PCV2兩種亞型，2016 年美國(guó)學(xué)者 Palinski 等[2]報(bào)道在患有豬皮炎腎病綜合征(PDNS)和繁殖障礙的母豬及其流產(chǎn)胎兒體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種新型的豬圓環(huán)病毒，將其命名為豬圓環(huán)病毒3型 (PCV3)，至此，PCV分為3種亞型。PCV3感染可導(dǎo)致母豬出現(xiàn)厭食癥狀，皮膚出現(xiàn)多灶性丘疹、斑點(diǎn)和淺表性皮炎，生產(chǎn)性能下降 ； 妊娠母豬發(fā)生繁殖障礙，產(chǎn)弱胎、死胎、木乃伊胎和弱仔豬，病情嚴(yán)重甚至造成急性死亡[2-3]； 不同胎齡胎兒均可發(fā)生流產(chǎn)。2016年美國(guó)多個(gè)州豬群證實(shí)存在PCV3感染[2,4]，之后韓國(guó)、中國(guó)、意大利、波蘭、巴西等國(guó)家陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病毒[5-8]。我國(guó)分別在廣東、廣西、海南、江西、福建、湖南、江蘇、河南、山東、貴州、遼寧等某些發(fā)生繁殖障礙母豬以及急性死亡仔豬體內(nèi)檢測(cè)出PCV3[3,9-11]。截至目前，我國(guó)已有多省展開對(duì)PCV3的流行病學(xué)調(diào)查[9-13]，而關(guān)于河北省PCV3的分子流行病學(xué)調(diào)查以及遺傳變異分析未見有報(bào)道。

PCV3病毒粒子呈二十面體結(jié)構(gòu)，無囊膜，基因組為單股DNA，全長(zhǎng)2 000 bp，包含3個(gè)主要開放閱讀框 (ORF)，分別編碼Rep蛋白、Cap蛋白和未知功能的ORF3[14]。其中，ORF2編碼的Cap蛋白由214個(gè)氨基酸組成，并且Cap蛋白是PCV3的主要結(jié)構(gòu)蛋白和抗原蛋白，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。本試驗(yàn)基于PCV3Cap基因?qū)颖笔?014-2018年P(guān)CV3展開分子流行病學(xué)調(diào)查，并參考國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的多個(gè)基因序列繪制遺傳進(jìn)化樹，分析PCV3的遺傳變異趨勢(shì)，為進(jìn)一步對(duì)PCV3的防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 樣品采集自2014-2018年河北省不同地區(qū)共209份豬新鮮脾臟、腎和淋巴結(jié)等，置于-80 ℃保存，本試驗(yàn)所用毒株見表1。

表1 本試驗(yàn)中所用到毒株信息Table 1 Information about strains in this test

1.2 主要試劑 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒、2×TaqPCR Master Mix、MarkerⅢ，均購自天根生化科技(北京)有限公司；pMDTM19-T vector，購自TaKaRa公司；Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)文獻(xiàn)[3]合成完整的擴(kuò)增PCV3Cap基因的上、下游引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具體序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.4 病毒總DNA的提取 將研磨好的組織病料離心，取上清液200 μL，按照病毒基因組DNA提取試劑盒操作說明書進(jìn)行核酸提取，最后用50 μL DNase/RNase-Free Water 溶解，于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品PCV3的PCR檢測(cè) 將樣品提取的DNA進(jìn)行PCR，PCV3反應(yīng)體系為：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，PCV3-F/R(20 μmol/L)0.5 μL，DNA 5 μL，H2O 6.5 μL。PCV3 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸40 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.6Cap基因的克隆及序列分析 回收Cap基因的目的片段并連接pMDTM19-T載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定陽性的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用Lasergene軟件中MegAlign進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列分析，使用Mega6.0 軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 2014-2018年河北省PCV3感染情況 對(duì)209份疑似發(fā)病樣本進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，41份病料為PCV3 核酸陽性，陽性率為19.61%(41/209)。

2.2Cap基因的擴(kuò)增及克隆 選9份PCV3陽性樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)，回收目的片段分別克隆到pMDTM19-T中，將含重組質(zhì)粒的陽性菌液分別測(cè)序并經(jīng)BLAST比對(duì)。結(jié)果表明，擴(kuò)增得到的片段為PCV3Cap基因，上傳GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號(hào)見表1。

圖1 PCR擴(kuò)增部分陽性樣品Cap基因結(jié)果Fig. 1 RCR results about Cap gene of part of positive samplesM: MarkerⅡ; 1～4:部分陽性樣品M: MarkerⅡ; 1～4:Part of positive samples

2.3Cap基因氨基酸序列分析 經(jīng)序列測(cè)定，Cap基因總長(zhǎng)度為645 bp，編碼214個(gè)氨基酸。通過MegAlign軟件分析比對(duì)，結(jié)果顯示，河北省9株P(guān)CV3Cap基因序列之間核苷酸同源性為 97.5%～99.5%，編碼氨基酸的同源性為93.5%～98.6%。與國(guó)內(nèi)分離株Cap基因氨基酸的同源性為93.5%～99.5%，與國(guó)外分離株P(guān)CV3-US/MO2015、PCV3-US/MN2016、PCV3-US/SD2016、PCV3-KS/21960、PCV3-BR/RS/6、PCV3-BR/RS/8的同源性為94.4%～99.1%(見圖2)。

河北省9株P(guān)CV3Cap基因氨基酸與國(guó)內(nèi)外分離株相比，PCV3/CH/HB/HD/2017毒株在第23位由L突變?yōu)镕，PCV3/CH/HB/CD/2018毒株第91位R突變?yōu)閃；PCV3/CN/Hebei-1409/2014 毒株第118位L突變?yōu)镻，第131位 L為突變F，PCV3/CN/Hebei-1613/2016 毒株第116 位C突變?yōu)镚；第118位L突變?yōu)镻；PCV3/CN/Hebei-1607/2016毒株第193 位 I突變?yōu)镵；PCV3/CN/Hebei-388/2015毒株第 157位G突變?yōu)長(zhǎng)；PCV3/CN/Hebei-1407/2014第206 位S突變?yōu)镕。

2.4Cap基因序列進(jìn)化樹分析 選取9個(gè)毒株與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的PCV3Cap基因序列進(jìn)行比較，并建立遺傳進(jìn)化樹(圖3)。結(jié)果顯示，獲得的9個(gè)毒株處于不同的進(jìn)化分支上，其中PCV3/CN/Hebei-1407/2014、PCV3/CN/Hebei-1709/2017、PCV3/CH/HB-CD/2018三個(gè)毒株與美國(guó)PCV3-US/MO2015、PCV3-KS-29160和巴西PCV3-BR/RS/6處于同一進(jìn)化分支，屬于3b亞群；PCV3/CN/Hebei-1607/2016、PCV3/CN/Hebei-0259/2017、PCV3/CN/Hebei-388/2015、PCV3/CH/HB/HD/2017四個(gè)毒株與美國(guó)PCV3-US/SD2016和巴西PCV3-BR/RS/8處于同一分支，屬于3a亞群；除此之外，還有江西PCV3/CN/Jiangxi-62/2016毒株和山東 PCV3/CN/Jiangxi-62/2016毒株等；PCV3/CN/Hebei-1409/2014、PCV3/CN/Hebei-1613/2014兩個(gè)毒株與PCV3-CN/FuJian-820-2016處于一個(gè)分支，屬于3c亞群。

圖2 Cap基因編碼氨基酸序列分析Fig. 2 Sequence analysis of Cap gene amino acid

圖3 Cap基因遺傳進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of Cap gene

3 討論

自2016年美國(guó)首次檢出PCV3以來，我國(guó)多個(gè)省市相繼報(bào)道在豬群中存在PCV3感染。從各省調(diào)查結(jié)果來看，不同省份陽性率大致為12.5%～44.63%，分別為福建12.5%[12]、河南30.26%[15]、華南地區(qū)豬場(chǎng)44.63%[8]。本試驗(yàn)中，河北的陽性率為19.61%。PCV2感染可造成機(jī)體免疫力減低和其他病毒的繼發(fā)感染[16]。對(duì)PCV3陽性樣品進(jìn)一步進(jìn)行PCV2檢測(cè)，結(jié)果顯示，PCV2陽性率為92.68%(38/41)。PCV3與PCV2感染之間的關(guān)系是下一步研究的一個(gè)重要方向。

Cap基因遺傳進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)毒株分別位于3a、3b亞群和3c亞群，說明2014-2018年河北省PCV3存在3個(gè)亞群，且不同亞群區(qū)分與年份和地域相關(guān)性不大，呈多樣化趨勢(shì)。從全國(guó)多省的分子流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)分析，PCV3主要還是以3a和3b亞型為主要流行趨勢(shì)，個(gè)別省份有3c亞群出現(xiàn)。不同亞群間是否存在致病力的差異還有待研究。

Cap基因編碼病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白和抗原蛋白，是PCV3分子流行病學(xué)調(diào)查的最佳基因。本試驗(yàn)獲得的9個(gè)分離株，與國(guó)內(nèi)外分離株氨基酸的同源性為 93.5%～99.5%，Cap基因編碼氨基酸在不同部位均有1～3個(gè)位點(diǎn)的突變，這些位點(diǎn)的突變是否會(huì)引起該蛋白和抗原表位發(fā)生變異，這些將作為以后臨床研究的對(duì)象。此次通過PCV3基因序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)河北省自2014年豬群中即存在PCV3的感染，因此要時(shí)刻加強(qiáng)對(duì)進(jìn)口種豬及肉制品的檢驗(yàn)檢疫工作，從源頭控制新型或未知病毒的傳入。本試驗(yàn)將為河北省PCV3的監(jiān)測(cè)、流行和防控補(bǔ)充可靠的數(shù)據(jù)。