四川部分地區(qū)半舍飼肉羊消化道蠕蟲感染調(diào)查

葉勇剛, 肖 璐， 魏 勇， 康潤敏， 于吉鋒， 張 濤, 葉建強(qiáng)， 曹 冶， 謝 晶， 李興玉， 潘 夢, 林 毅, 孫文平, 戴卓建， 廖黨金

(1. 四川省畜牧科學(xué)研究院， 四川成都610066 ； 2. 動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 四川成都610066 ; 3. 四川省涼山州畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所， 四川西昌615042 ; 4. 四川省九龍縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局， 四川九龍626200)

消化道蠕蟲病在全世界范圍廣泛分布，是羊寄生蟲病中對(duì)羊危害最大的一類寄生蟲病，羊感染消化道蠕蟲，通常導(dǎo)致羊消化不良、貧血、消瘦，甚至死亡[1-3]； 每年給養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。一些羊的寄生蟲病還是非常重要的人獸共患病，如包蟲病、多頭蚴和片形吸蟲病等[4-6]。

四川位于我國西南，畜禽寄生蟲蟲種資源豐富，已報(bào)道的寄生蟲種類多達(dá)671種[7]。近年來四川大力發(fā)展養(yǎng)羊業(yè)，養(yǎng)羊規(guī)模持續(xù)穩(wěn)定增長，據(jù)2017年國家統(tǒng)計(jì)年鑒數(shù)據(jù)，2016年底四川肉羊存欄1 761.3 萬只，居全國第6位，羊肉產(chǎn)量26.9萬噸，居全國第5位，已成為我國肉羊生產(chǎn)大省[8]。四川肉羊養(yǎng)殖多以半舍飼化養(yǎng)殖模式，即放養(yǎng)加補(bǔ)飼為主，生產(chǎn)規(guī)模化程度、舍飼化水平和生產(chǎn)效率都不高[9]，多數(shù)養(yǎng)殖場在寄生蟲病防控方面，多采取春秋兩季或更頻繁的預(yù)防性驅(qū)蟲[10-11]，雖基本能夠控制寄生蟲病的發(fā)生，但由于連年不更換、或不針對(duì)性地使用藥物，寄生蟲病耐藥問題也日益突出。而近年來，針對(duì)四川羊的寄生蟲病流行病學(xué)調(diào)查多局限于縣、市或州的調(diào)查，較為系統(tǒng)的調(diào)查多在20年前，專門針對(duì)半舍飼化養(yǎng)殖模式的羊寄生蟲病調(diào)查更是未見報(bào)道[12-16]。基于此，試驗(yàn)通過糞便蟲卵定量檢測、寄生蟲感染陽性羊尸體剖檢、消化道蠕蟲形態(tài)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal transcribed spacer,ITS)基因擴(kuò)增鑒定,對(duì)四川半舍飼養(yǎng)殖肉羊流行的消化道蠕蟲病開展調(diào)查，以掌握其流行實(shí)況，為本地區(qū)該養(yǎng)殖模式下的肉羊寄生蟲病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查區(qū)域和時(shí)間 調(diào)查在2018年4月-2018年10月進(jìn)行，主要針對(duì)四川半舍飼肉羊養(yǎng)殖的主產(chǎn)區(qū)，涉及四川的6個(gè)市州12個(gè)區(qū)縣。其中A、B、C和D位于四川西南涼山州境內(nèi)的布拖縣、昭覺縣和西昌市安寧鎮(zhèn)，E、F和G位于四川東北部巴中市境內(nèi)的南江縣和恩陽區(qū)，H和I位于四川東北部達(dá)州市的宣漢縣和萬源市,J和K位于四川西部甘孜州境內(nèi)的九龍縣和丹巴縣、L位于四川中部眉山市境內(nèi)的仁壽縣，M位于四川東南部自貢市的富順縣。

1.2 糞樣的收集和檢查 從13個(gè)不同羊群收集綿羊或山羊新鮮直腸糞便共計(jì)289份，每份不低于30 g (其中A、B、C和D場飼養(yǎng)涼山半細(xì)毛羊，樣品數(shù)分別為28、41、20份和10份；E和L場飼養(yǎng)南江黃羊，樣品數(shù)均為20份；F場飼養(yǎng)小尾寒羊，樣品數(shù)為30份；G場飼養(yǎng)波爾山羊和南江黃羊，分別采樣10份，樣品數(shù)為20份；H場飼養(yǎng)波爾山羊，樣品數(shù)為20份；I場飼養(yǎng)川中黑山羊，樣品數(shù)為20份；J和K場飼養(yǎng)本地雜交山羊，樣品數(shù)均為20份；M場飼養(yǎng)川南黑山羊，樣品數(shù)為20份)，單獨(dú)存放于透明塑料采樣袋中并做好標(biāo)記，置于裝有冰袋的泡沫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室鏡檢。蟲卵和每克糞便蟲卵數(shù)(Egg per gram,EPG)的鑒定，主要采用沉淀法和Liao D J[17]建立的方法進(jìn)行判定。絳蟲主要檢查糞便中是否有孕卵節(jié)片，并根據(jù)形態(tài)特征初步判定種類。

1.3 消化道蠕蟲的收集、保存和鑒定 13個(gè)羊群中糞便蟲卵檢測陽性的19只病弱羊(E場3只羊、A場、B場、G場和J場分別為2只羊，其余場1只羊)，按蠕蟲學(xué)完全剖檢法進(jìn)行。將被檢羊剝皮后剖開胸腔和腹腔，將內(nèi)部臟器依次按系統(tǒng)分離，將食道、胃、小腸、結(jié)腸、盲腸、肝臟、胰腺、腸系膜等分開放入搪瓷盆內(nèi)逐一檢查，仔細(xì)挑出所有的蠕蟲，進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定[18-19]。

1.4 消化道蠕蟲的分子鑒定

1.4.1 DNA提取和PCR 對(duì)DNA的提取主要針對(duì)吸蟲和線蟲。挑取不同種的消化道蠕蟲成蟲各1條，研磨后用TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)提取蟲體基因組DNA。以引物NC 5 (5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′)和引物NC 2(5′-TTAGTTTCTTTTCCTCCGCT-3′)作為擴(kuò)增消化道線蟲的ITS和5.8 S基因序列的保守引物；以引物BD 1(5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′)和引物BD 2 (5′-TATGCTTAAATTCAGCGGGT-3′)作為擴(kuò)增吸蟲ITS和5.8 S基因序列的保守引物。分別以線蟲和吸蟲DNA為模板，線蟲反應(yīng)體系為：2 ×TaqPCR Master Mix (TIANGEN) 12.5 μL，NC 5和NC 2各0.5 μL，DNA模板2 μL，dd H2O 9.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s， 72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。 吸蟲反應(yīng)體系為：2 ×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，BD 1和BD 2各1 μL，DNA模板1.5 μL，dd H2O 9 μL；反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.4.2 DNA測序及進(jìn)化樹構(gòu)建 所有陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至擎科生物有限公司進(jìn)行測序。用Seqman軟件查看測序峰圖并進(jìn)行序列拼接，隨后在NCBI網(wǎng)站對(duì)序列進(jìn)行BLAST比對(duì)并將序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫。利用MEGA-X軟件采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap重復(fù)值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果

2.1 糞樣檢查 結(jié)果顯示，肉羊消化道蠕蟲感染陽性率為64.36%(186/289)，其中線蟲感染率最高，達(dá)60.55%(175/289)，其次為片形吸蟲、同盤吸蟲和絳蟲，陽性率分別為15.22%(44/289)、14.88%(43/289)和2.08%(6/289)；另外線蟲、片形吸蟲和同盤吸蟲的平均EPG值分別為1 197(56～28 187)、527(74～1 407)和413(63～1 291)。每個(gè)養(yǎng)殖場羊消化道線蟲的感染率均明顯高于吸蟲或絳蟲(H場除外)，各養(yǎng)殖場糞便蟲卵檢測結(jié)果見表1。

2.2 消化道蠕蟲的剖檢 剖檢19只經(jīng)蟲卵檢測為陽性的病弱羊發(fā)現(xiàn)，捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的感染率最高(84.21%)，其次為夏伯特線蟲、毛首線蟲、肝片形吸蟲、同盤吸蟲、奧斯特線蟲、食道口線蟲、大片形吸蟲、莫尼茨絳蟲、背板線蟲和列葉吸蟲。成蟲發(fā)現(xiàn)數(shù)量最多的為列葉吸蟲，達(dá)到3 147條，最少的為莫尼茨絳蟲，僅3條，見表2。對(duì)采自3只羊的絳蟲節(jié)片進(jìn)行染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)2只羊單獨(dú)感染擴(kuò)展莫尼茨絳蟲，1只羊單獨(dú)感染貝氏莫尼茨絳蟲。

表1 不同養(yǎng)殖場羊消化道蠕蟲的感染情況Table 1 The infection of helminthes parasited in digestive tract of sheeps or goats in different farms

2.3 分子鑒定及進(jìn)化樹分析 PCR擴(kuò)增結(jié)果為陽性的產(chǎn)物，測序后拼接獲得15條含rDNA ITS的基因序列，登錄GenBank數(shù)據(jù)庫得到登錄號(hào)(MK397496、MK402081、MK402084-MK402088、MK472688、MK477543、MK530133、MK530935、MK811248、MK811249、MK818506和MK929282)。在線BLAST分析與NCBI基因庫中的鹿列葉吸蟲、肝片形吸蟲、大片形吸蟲、鹿同盤吸蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、羊夏伯特線蟲、粗紋食道口線蟲、羊毛首線蟲、達(dá)氏背板線蟲和奧斯特線蟲(不確定種)的ITS序列相似性達(dá)92.59%～100%，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果基本一致。

基于ITS序列構(gòu)建NJ樹，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所測的4個(gè)吸蟲樣品，處于3個(gè)大的不同分支。MK472688和MK929282處于同一大分支，其中MK472688與分離自中國和印度綿羊的肝片吸蟲(KJ789364和KX198630)處于同一分支，MK929282與分離自印度綿羊的大片形吸蟲(KX198631)處于同一小分支；MK530935與分離自印度大額牛的鹿同盤吸蟲(KU365321)處于同一大分支的小分支；MK477543與中國分離的鹿列葉吸蟲(KF008246)處于同一大分支的小分支，分別確定為肝片形吸蟲、大片形吸蟲、鹿同盤吸蟲和鹿列葉吸蟲，見圖1。所測的9個(gè)線蟲樣品處于3個(gè)大分支，分別屬于毛圓科、夏伯特科和毛首科；其中MK397496與分離自烏茲別克斯坦綿羊的達(dá)氏背板線蟲(KX929993)處于同一分支；MK818506(形態(tài)鑒定為普通奧斯特線蟲)與中國綿羊分離的奧斯特線蟲(HQ844228)處于同一分支；MK402081、MK402086和MK402087與分離自中國和美國綿羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(HQ944231和EU086386)處于同一分支；MK402084與分離自中國的粗紋食道口線蟲(KM200804)處于同一分支；MK402088和MK811249與分離自愛爾蘭綿羊的羊夏伯特線蟲(JF690981)處于同一分支；MK402085與分離自西班牙牛的羊毛首線蟲(FR870274)處于同一分支，分別確定為達(dá)氏背板線蟲、普通奧斯特線蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、粗紋食道口線蟲、羊夏伯特線蟲和羊毛首線蟲，見圖2。

表2 綿羊或山羊不同種消化道蠕蟲感染率、感染強(qiáng)度和寄生蟲部位Table 2 Species,organs of predilection,prevalence and intensity of infection of helminthes in sheeps or goats

3 討論

近年來，隨著養(yǎng)殖設(shè)施條件的改善和驅(qū)蟲藥物的普及使用，羊的寄生蟲病得到了較好的控制，但不針對(duì)性使用和常年不更換驅(qū)蟲藥的問題卻十分突出。據(jù)報(bào)道，在我國乃至全球，羊的消化道蠕蟲尤其線蟲的抗藥性問題已越來越普遍[20-22]。在本次調(diào)查的13個(gè)養(yǎng)殖場中，多數(shù)養(yǎng)殖場連續(xù)2年以上使用單一藥物進(jìn)行驅(qū)蟲，未曾做到輪換用藥和穿梭用藥。其中G場使用阿維菌素驅(qū)蟲3個(gè)月，線蟲感染陽性率已達(dá)55%，EPG均值為1 249(見表1)，已超過傳統(tǒng)驅(qū)蟲閾值[23]，若再執(zhí)行該場固有的春秋兩季驅(qū)蟲，已明顯不能有效控制寄生蟲病。此外，調(diào)查中有8個(gè)養(yǎng)殖場的羊感染吸蟲，除B、E和H場外，其余均沒有使用專門的抗吸蟲藥物，且部分羊的片形吸蟲和同盤吸蟲EPG值已超過500，需使用抗吸蟲藥物進(jìn)行驅(qū)蟲。

明確流行寄生蟲種類，是制定針對(duì)性防控寄生蟲病的前提。寄生蟲的形態(tài)學(xué)鑒定雖然簡單直觀，但也存在對(duì)鑒定人員經(jīng)驗(yàn)要求高和難以鑒別形態(tài)差異小的蟲種等缺陷，分子鑒定方法是對(duì)形態(tài)學(xué)鑒定方法的補(bǔ)充。核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列，是寄生蟲分類鑒定使用最廣泛的分子標(biāo)記，已被廣泛用于寄生蟲蟲種的分類和系統(tǒng)進(jìn)化研究[24-25]。本試驗(yàn)對(duì)所檢蠕蟲開展形態(tài)學(xué)和分子鑒定，明確了當(dāng)前四川半舍飼肉羊流行的消化道蠕蟲主要有肝片形吸蟲、大片形吸蟲、鹿同盤吸蟲、鹿列葉吸蟲、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲、羊夏伯特線蟲、粗紋食道口線蟲、羊毛首線蟲、達(dá)氏背板線蟲、普通奧斯特線蟲、擴(kuò)展莫尼茨絳蟲和貝氏莫尼茨絳蟲。除達(dá)氏背板線蟲外，其余蠕蟲均在《四川畜禽寄生蟲志》有報(bào)道[16]。

圖1 基于幾種吸蟲ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of the morphologically diagnosed trematodes based on ITS sequences by using the neighbour-joining method▲: 本試驗(yàn)所分離吸蟲 ▲: Trematodes isolated in this test

圖2 基于幾種線蟲ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of the morphologically diagnosed nematodes based on ITS sequences by using the neighbour-joining method▲: 本試驗(yàn)所分離線蟲 ▲: Nematodes isolated in this test

半舍飼養(yǎng)殖是一種早晚補(bǔ)充青干草或精料并適時(shí)放牧的一種養(yǎng)殖模式，該模式既能有效利用荒山草坡牧草資源，降低養(yǎng)殖成本，又能便于對(duì)羊群進(jìn)行管理，是四川非常普遍的一種養(yǎng)羊模式。羊群在荒山草坡活動(dòng)，接觸寄生蟲尤其消化道蠕蟲病原或中間宿主的機(jī)會(huì)比純?nèi)︷B(yǎng)羊群機(jī)會(huì)多；但同時(shí)其便于統(tǒng)一驅(qū)蟲管理，寄生蟲病的發(fā)生又比純放養(yǎng)羊群要低。四川位于我國西南，地域廣闊，開展半舍飼養(yǎng)羊多是在半農(nóng)半牧區(qū)或農(nóng)區(qū)，這些區(qū)域相比高原牧區(qū)，其氣候溫和、濕度適中，比較適于寄生蟲的生存和繁殖。據(jù)報(bào)道西南地區(qū)羊的寄生蟲種類有線蟲66種，吸蟲50種，絳蟲10種[26-28]。而本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)的12種蠕蟲在已報(bào)道的四川羊消化道蠕蟲中僅占一小部分，可能與養(yǎng)殖模式、所選區(qū)域和樣本數(shù)量較少，以及近年來對(duì)羊寄生蟲病防治的重視和驅(qū)蟲藥物的普及有關(guān)。另外，線蟲病在本次調(diào)查的13個(gè)養(yǎng)殖場中均有發(fā)現(xiàn)，場陽性率達(dá)100%，其中4個(gè)養(yǎng)殖場線蟲平均EPG達(dá)1 000以上；對(duì)羊的剖檢結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了羊線蟲病的高感染率和感染程度。為此，線蟲病是四川半舍飼肉羊寄生蟲病防控的重點(diǎn)，其次，一些養(yǎng)殖場需加強(qiáng)對(duì)吸蟲病的防控。本次調(diào)查結(jié)果對(duì)采取有效措施防控該養(yǎng)殖模式下的肉羊消化道蠕蟲病提供了重要科學(xué)依據(jù)。