XPO4基因對人肝癌細胞抑制作用的研究

吳 楠 劉 侃 王曉梅

1.深圳市南山區疾病預防控制中心疾病預防科，廣東深圳 518054；2.深圳大學醫學部腫瘤研究所，廣東深圳 518000

肝癌是全球高發的腫瘤之一，惡性程度高，預后生存期短，致死率高[1]。抑癌基因失活是肝癌發生發展機制中重要的遺傳學基礎[2]。2008年科學家應用特異性高的RNAi 篩選方法[3]，得到了12個新的抑癌基因，XPO4 就是其中一種。XPO4是細胞核轉運因子家族成員，可調節Smad3[轉化生長因子-β（TGF-β）信號傳導中的組分]和Eif5a（兩個密切相關的翻譯起始因子）[4-6]。XPO4 在細胞中的去除會引起細胞癌變的概率增加[7-8]。有研究表明，肝癌中XPO4 的表達降低與腫瘤大小及病理分級相關，XPO4 的缺失提示預后差，且可以作為一個獨立的危險因子[9-10]，目前利用XPO4基因開展腫瘤治療研究的報道較少。本研究構建表達XPO4基因的載體，研究XPO4基因對腫瘤細胞的抑制作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

真核表達質粒pcDNA3.1 購自Invitrogen公司；攜XPO4基因質粒pCR4-TOPO-XPO4 購自Invitrogen公司；人肝癌細胞株SK-Hep1（XPO4基因完全缺失）由香港中文大學胡寶光博士惠贈；大腸埃希菌菌株DH5a 由深圳大學醫學部腫瘤研究所保存。

1.2 方法

1.2.1 pcDNA3.1-XPO4 載體的構建 XPO4基因上游引物：5′-GGGGGTACCATGGTCAATAATGAACAA-3′；下游引物：5′-GGGGATATCTTATTTTACACAAAGGAG-3′。以pCR4-TOPO-XPO4 為模板，PCR 擴增XPO4基因。酶切pcDNA3.1 質粒和目的基因XPO4，16℃連接過夜（試劑盒購自Takara公司）。轉化大腸埃希菌DH5a，無內毒素質粒提取（試劑盒購自OMEGA公司）。

1.2.2 細胞體外轉染 將SK-Hep1 細胞接種至6 孔板，每孔2 mL，細胞密度為2×105個/mL，12 h后進行質粒轉染，pcDNA3.1-XPO4 質粒轉染SK-Hep1 細胞，按 照Lipofectamine3000 轉染試劑（Invitrogen公司）的說明書進行。

1.2.3 蛋白表達檢測 按照Western Blot 實驗方法，主要試劑XPO4 一抗（Thermo公司）；β-actin 一抗（北京博奧森公司）；羊抗兔二抗（武漢博士德公司）。

1.2.4 XPO4基因體外抑瘤實驗 以SK-Hep1 細胞接種于96 孔培養板中，每孔100 μL，細胞密度為2×104個/mL。12 h后進行質粒轉染，采用CCK-8 檢測細胞存活率。將SK-Hep1 細胞接種至6 孔板，每孔2 mL，細胞密度為2×105個/mL，12 h后進行質粒轉染，采用Annexin V-FITC/PI 檢測細胞凋亡。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用T檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；計數資料用率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 XPO4基因PCR 產物鑒定

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測XPO4 的PCR 產物，在3000～4000 bp 有一條帶，大小與預期相符（圖1）。

2.2 重組載體的酶切鑒定

用KpnⅠ和EcorⅤ雙酶切pcDNA3.1-XPO4，對照質粒為pcDNA3.1，XPO4基因正確插入pcDNA3.1載體中（圖2）。

2.3 pcDNA3.1-XPO4 轉染后XPO4 蛋白表達

圖1 XPO4 的PCR 擴增圖

圖2 pcDNA3.1-XPO4 質粒酶切圖

在重組質粒pcDNA3.1-XPO4 轉染組中，有XPO4蛋白表達，在SK-Hep1 細胞對照組和pcDNA3.1 空質粒轉染組中，沒有XPO4 蛋白表達（圖3）。

圖3 Western BloT檢測XPO4 蛋白表達

2.4 pcDNA3.1-XPO4 體外對腫瘤細胞增殖的抑制作用

重組質粒pcDNA3.1-XPO4 轉染組的細胞存活率低于SK-Hep1 細胞對照組和pcDNA3.1 空質粒轉染組，差異有統計學意義（P<0.001）。SK-Hep1 細胞對照組的細胞存活率與pcDNA3.1 空質粒轉染組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖4）。2.5 pcDNA3.1-XPO4 體外對腫瘤細胞凋亡的作用

圖4 CCK-8 檢測SK-Hep1 細胞增殖

重組質粒pcDNA3.1-XPO4 轉染組細胞的早期凋亡率[（13.89±1.62）%]高于SK-Hep1 細胞對照組[（5.14±1.13）%]和pcDNA3.1 空質粒轉染組[（5.79±2.11）%]，差異有統計學意義（P<0.001）。SK-Hep1 細胞對照組細胞的早期凋亡率與pcDNA3.1 空質粒轉染組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖5）。

3 討論

圖5 Annexin V-FITC/PI 檢測XPO4 表達對SK-Hep1 細胞凋亡的影響

肝癌發病機制復雜，常與相關基因的突變或積累有關。基因治療已成為癌癥治療的重要研究領域，因此，尋找高效的抑癌基因是腫瘤治療進一步發展的重要方向。近年來研究發現，真核細胞的細胞核與細胞質之間存在物質交換，細胞核向細胞質輸出許多種類的大分子。出核轉運通過核孔復合物（NPC）通道和選擇性轉運蛋白，同時也依賴核輸出信號結合受體，如XPO4[4]。XPO4 也稱為Exportin 4，可能是一種重要的抑癌基因。本研究探討XPO4 在人肝癌細胞株SKHep1 中的表達對該腫瘤細胞生長增值的影響，結果顯示，pcDNA3.1-XPO4 質粒轉染至SK-Hep1 肝癌細胞中，XPO4 在SK-Hep1 中表達。表達的XPO4可以抑制SK-Hep1 細胞的生長增殖和誘導凋亡。XPO4 抑制腫瘤的機制可能是通過調節Eif5a 和Smad3 蛋白水平來進行[11]。細胞中XPO4 缺失，影響Smad3 出核，而Smad3 蛋白是TGF-β 的配體，細胞核Smad3 的增加，伴隨TGF-β基因上調，這種影響很好地解釋了當XPO4基因缺失導致TGF-β信號通路的紊亂，使細胞逃逸TGF-β 介導的生長抑制效應，導致多種腫瘤發生[5，12-13]。近年來的研究發現，Eif5a 在人癌細胞中總體上來說是過度表達的，腫瘤的惡性程度尤其是腫瘤的惡性增值能力、轉移能力與腫瘤細胞內表達的Eif5a密切相關，如果細胞內缺乏XPO4 則有助于Eif5a 的出核，通過XPO4-Eif5a 這一信號通路刺激腫瘤細胞增殖[14-16]。

為了揭示XPO4 對腫瘤細胞的影響，本研究制備了攜帶表達XPO4基因的pcDNA3.1-XPO4 質粒載體，選擇肝癌細胞SK-Hep1 進行實驗。SK-Hep1 細胞系中缺失XPO4基因，通過轉染SK-Hep1，引起XPO4在細胞中表達。CCK-8 檢測細胞增殖顯示，重組質粒pcDNA3.1-XPO4 轉染組的細胞存活率低于SK-Hep1細胞對照組和pcDNA3.1 空質粒轉染組，差異有統計學意義（P<0.001），提示XPO4基因表達能抑制腫瘤細胞生長。重組質粒pcDNA3.1-XPO4 轉染組細胞的早期凋亡率高于SK-Hep1 細胞對照組和pcDNA3.1空質粒轉染組，差異有統計學意義（P<0.001），提示XPO4基因表達對腫瘤細胞有殺傷作用。SK-Hep1 細胞對照組的細胞存活率和早期凋亡率和pcDNA3.1空質粒轉染組比較，差異無統計學意義（P>0.05），提示XPO4基因可能參與并發揮重要的抑制腫瘤進程的作用。

Liang 等[10]通過對臨床肝癌手術患者的病理檢測，發現XPO4 在癌旁組織中的表達，高于腫瘤組織，且腫瘤越大表達量越低，提示XPO4可能參與腫瘤進程。Zender 等[11]將肝癌易感小鼠模型和RNAi 技術結合，在小鼠模型中將XPO4 沉默后可引起腫瘤，因此也進一步獲得XPO4 作為抑癌基因的證據。

綜上所述，肝癌細胞系SK-Hep1 模型不表達XPO4，而通過構建的重組質粒載體轉染，可以在肝癌細胞成功表達XPO4基因，有效抑制腫瘤細胞的增殖和誘導凋亡。因此XPO4基因作為抑癌基因對腫瘤治療具有極大的潛力，增強XPO4基因的表達可以為臨床治療肝癌提供參考依據。同時仍需深入研究肝癌的發生機制[17-18]，更好地了解XPO4基因抑癌的原因，為疾病的診斷與治療提供新的方向。