雙膦酸鹽類藥物的生物學應用研究進展

高歡 尹東鋒

雙膦酸鹽類藥物被認為是治療與骨相關疾病的一線藥物，但其最早是用于紡織和石油工業的防腐劑和絡合劑[1]。上世紀六十年代，Fleisch 等[2]發現了它們的藥理活性，骨礦物質的主要成分是羥基磷灰石[Ca10（PO4）6（OH）2，HA]，通過與羥基磷灰石結合抑制其溶解來防止鈣化，因此發現了雙膦酸鹽類藥物在骨骼疾病中的潛力。隨著研究的不斷深入，各種親和力高、毒副作用小、治療作用強的新型雙膦酸鹽類藥物接連問世，成為Paget 病、骨質疏松癥、惡性腫瘤骨轉移相關的高鈣血癥的一線治療藥物[3]，為大多數骨疾病患者所服用，尤其是絕經后患有骨質疏松癥的婦女。但雙膦酸鹽類藥物的口服生物利用率低，因此有文獻提出了幾種遞藥系統來改善其生物利用度的問題[4]。

1 雙膦酸鹽的結構特征及作用機制

雙膦酸鹽（Bisphosphonates，BPs）是上世紀70年代發展起來的抗代謝性骨病的一種新藥，治療Paget 病、骨質疏松癥、骨轉移、惡性腫瘤相關的高鈣血癥和小兒骨病[5]。BPs 是焦磷酸鹽的不可水解類似物，焦磷酸鹽和雙膦酸鹽之間的結構差異是氧原子連接的兩個磷酸根被一個碳原子取代，即雙磷酸鹽中的P-C-P 基團取代了焦磷酸鹽的P-O-P基團，是雙膦酸鹽特有的結構，兩個基團R1和R2連接到雙膦酸鹽的中心碳原子上，如果R1為羥基（-OH），則雙膦酸鹽對羥基磷灰石的親和力可以增加，如阿侖膦酸鹽[6]。雙膦酸鹽中的氧原子可以與HA 中的鈣離子螯合，而表現出對骨的強親和力（見圖1）。

圖1 焦磷酸鹽（A）和雙膦酸鹽（B）的基本結構式

目前，臨床上所使用的BPs 根據其上市時間和結構特點分為三代（見表1）。第一代雙膦酸鹽藥物，如依替膦酸鹽和氯膦酸鹽，在其結構中不含氮原子，可作為焦磷酸鹽的類似物。它們被代謝為ATP 的細胞毒性類似物，腺苷5'-（β，γ-二氯亞甲基）-三磷酸抑制線粒體腺嘌呤核苷酸轉運酶（ANT），并最終引發細胞凋亡[7]。第二代和第三代雙膦酸鹽，其烷基鏈中含有氮原子，如阿侖膦酸鹽或帕米膦酸鹽，其效力比第一代雙膦酸鹽高10～100倍，并顯示可通過甲羥戊酸途徑抑制骨吸收[8]。該途徑是異戊二烯化所必需的，其導致法尼基或香葉基香葉基部分轉移至靶蛋白，如Rho、Rac、Ras 或Rab，這對于細胞骨架組織和細胞形態很重要。 如果沒有異戊二烯化，破骨細胞的活性就會降低，并發生凋亡[9]。此外，近年來的研究發現，雙膦酸鹽除具有很強的抗破骨細胞的作用之外，還具有一定的抗腫瘤和抗血管生成作用[10]。

表1 不同雙膦酸鹽進入美國市場的時間

2 雙膦酸鹽類藥物的臨床應用

2.1 骨質疏松癥骨質疏松癥（Osteoporosis）是一種由于多種原因導致的以骨量低、骨組織微結構損壞，導致骨脆性增加為特征的全身性骨病，患此病者發生骨折的可能性更大[11]，絕經后婦女的發病率最高。治療骨質疏松癥的藥物主要有抑制骨吸收藥和促進骨形成藥兩類。雙膦酸鹽于上世紀70年代和80年代開始用于治療骨質疏松癥[12]。

Iba 等[13]調查了雙膦酸鹽（阿侖膦酸鈉或利塞膦酸鹽）對55例絕經后婦女骨質疏松癥患者持續治療10年的療效，結果表明，腰椎骨密度在過去的10年中持續增加，而整個髖部的骨礦物質密度（BMD）略有下降，而在1/3 半徑處的BMD 在過去的10年中沒有任何顯著變化。開始治療后血清Ca值顯著降低，并且從第二年開始在參考范圍內穩定。從開始治療的第二年起，骨吸收標記物（如uNTX和TRAP5b）顯著下降，此后未觀察到明顯變化。因此，連續使用阿侖膦酸鈉或利塞膦酸鹽10年可以作為絕經后骨質疏松癥患者的治療選擇。其他幾項實驗研究也證實了阿侖膦酸鈉和其他雙膦酸鹽藥物對絕經后婦女骨質疏松癥的治療效果[14，15]。以上臨床研究中的雙膦酸鹽類藥物都可以降低絕經后婦女的骨折風險。由于比較研究需要大樣本且成本昂貴，因此將來不太可能進行更多此類實驗。另外，雙膦酸鹽類藥物也可以與多肽激素類骨調節藥和糖皮質激素聯合用于中重度的骨質疏松癥的治療[16，17]。

2.2 骨轉移和惡性高鈣血癥骨骼是惡性腫瘤轉移的第三大常見部位，研究表明，大約70%的晚期癌癥患者會出現骨轉移[18]，除轉移外，多達30%的癌癥患者在其轉移過程中會出現高鈣血癥[19]。臨床治療高鈣血癥的方式是靜脈注射雙膦酸鹽。破骨細胞活化被認為是骨轉移的標志，雙膦酸鹽具有直接和間接的抗腫瘤特性，以及對骨的高親和力，被建議用于治療轉移性骨病。Seo 等[20]通過將氨基雙膦酸鹽與緩激肽拮抗劑BKM-570 綴合而生成BKM1740 化合物，在骨轉移模型中這種化合物通過直接抑制survivin 過表達而誘導轉移性癌細胞凋亡來抑制腫瘤細胞的生長。

雙膦酸鹽也可以與抗腫瘤劑和放射性核素綴合來治療轉移性骨病。Herbert 等[21]將氨基雙膦酸鹽（阿倫膦酸鹽，帕米膦酸鹽）與核苷類似物5-FdU共價連接，獲得結合了兩種不同細胞毒性功能的N4-[烷基-（羥基膦酰基）膦酸酯]-胞苷。5-FdU-阿侖膦酸鹽（5-FdU-aln）與羥基磷灰石的體外結合顯示，與5-FdU 相比，這些BP 的結合增加了6 倍。在一組人類腫瘤細胞系上測試了5-FdU-aln 的細胞毒性，可抑制5%～38%的生長；而在骨轉移模型中，與未修飾的母體藥物相比，5-FdU-aln 是癌癥特異性的尋骨劑。Marija 等[22]制備了一種基于Fe3O4和涂覆兩個親水性配體，二膦酸二甲酯（MDP）和1-羥基乙烷-1,1-二膦酸酯（HEDP），99mTc-雙膦酸酯涂層的磁性納米粒（MNPs），結果顯示以99mTc 放射性 標 記 包 被 的MNPs，Fe3O4-MDP MNP和Fe3O4-HEDP MNP 在生理鹽水和血清中保持穩定持續24h；閃爍顯像研究與離體生物分布研究表明放射性標記的MNP 具有很高的體內穩定性，且肝臟和腎臟攝取顯著，可以作為骨靶向納米劑應用。

3 雙膦酸鹽官能化的研究與應用

目前，雙膦酸鹽主要作為骨疾病的一線治療藥物。然而，由于其口服生物利用率低及其嚴重的不良反應，如下頜骨壞死、腎功能損傷等，限制了其應用。雙膦酸鹽對骨礦物質的高親和力可以與熒光素、放射性核素、抗腫瘤藥物等綴合，實現向骨的靶向作用。在過去幾十年中已經開發了幾種綴合策略，確保雙膦酸鹽較高的體內穩定性，從而在綴合后保留其生物學功能。

3.1 雙膦酸鹽官能化的成像劑在腫瘤靶向中，熒光素廣泛應用于腫瘤的臨床前研究，用于示蹤腫瘤細胞和腫瘤組織。雙膦酸鹽與熒光素的綴合已成功用于骨代謝的檢測和體內示蹤。Robert 等[23]報道由甲狀旁腺激素（PTH）治療引起的加速骨丟失（卵巢切除）（OVX）和合成代謝骨增加的小鼠模型中使用近紅外（NIR）熒光標記的帕米膦酸鹽檢測局部骨礦沉積的變化中發現，與未處理的OVX 對照組相比，使用PTH 治療的雙膦酸鹽結合速率常數增加了36 倍。因此，基于熒光標記的帕米膦酸鹽監測結合動力學是一種高度敏感、局部特異性的監測骨礦物質沉積變化的方法，有可能應用于人類骨質疏松癥和骨轉移的治療。Nimrod 等[24]通過將NIR染料Cy-7 與屬于非熒光雙磷酸酯納米粒的N-（3-氨基丙基）甲基丙烯酰胺（APMA）單體單元的伯氨基共價偶聯，制備了NIR 熒光交聯雙磷酸酯納米粒（MA-Glu-BP）NP。通過與羥基磷灰石的相互作用說明了（MA-Glu-BP）NP 對鈣的親和力。因此，NIR-BP 成像技術未來可以實現術中對骨轉移、骨生長和微鈣化的成像。

雙膦酸鹽還可以與放射性核素99mTc，89Sr，186/188Re 等通過螯合作用偶聯，用于診斷和治療的生物學評估。

3.2 雙膦酸鹽官能化的聚合物納米粒子聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）制成的可生物降解的納米顆粒可以用雙膦酸鹽修飾[25]。如，Elisabetta 等[26]制備了由PLGA 與阿侖膦酸鹽（ALN）綴合的聚合物形成的納米顆粒（NPs）。為了顯示ALN 與PLGA結合并產生NP 后，ALN 是否保留抗破骨細胞的特性，比較了其對肌動蛋白環生成、凋亡和I型膠原降解的影響。實驗結果表明PLGA-ALN NPs 破壞肌動蛋白形成，誘導凋亡并抑制膠原蛋白降解。因此，PLGA-ALN NPs可能有助于抑制與疾病相關的骨降解。

此外，其他的大分子生物材料，如聚乙二醇（PEG）和聚氧乙烯硬脂基醚（Brij）等，通過綴合不同的雙膦酸鹽所制備的納米粒子也已被廣泛研究。

3.3 雙膦酸鹽官能化的脂質體雙膦酸鹽損害破骨細胞的功能并阻止骨吸收，其機理已被廣泛研究。然而，雙膦酸鹽對成骨細胞分化成軟骨細胞和鈣沉積的可能作用剛被證實。而且，來自單核細胞譜系的細胞能夠刺激成骨細胞增殖。因此，成骨細胞對各種因素的敏感性需要進一步研究。Okada 等[27]制備了脂質體氯膦酸鹽，用脂質體氯膦酸鹽或來自脂質體氯膦酸鹽的條件培養基處理源自骨髓的基質細胞的原代培養物，通過體內實驗、實時RT-PCR分析測定顯示堿性磷酸酶活性以及Runx2和Dlx5的mRNA 水平均有所增加，并且通過蛋白質印跡分析，從脂質體氯膦酸鹽的條件培養基中收集的外泌體中存在RANK 蛋白，總之，這些數據表明成骨細胞分化響應于氯膦酸鹽的可溶性RANKL，包含外來體促進的。

在另外兩項研究中發現，表面雙膦酸鹽修飾的脂質體均通過對HA 的吸附能力來考察其靶向性，實驗結果表明所制備的脂質體均有骨靶向性，但沒有進行體內研究，因此這兩種脂質體是否確實在骨骼中分布良好未知[28，29]。

4 其他生物醫學用途

雙膦酸鹽由于其對骨骼的強親和力，可以作為抑制植入物附近骨吸收的涂層劑。他們可以單獨涂覆在鈦的表面，也可以涂覆在羥基磷灰石涂層的鈦的植入物的表面，因此可以固定植入物在骨骼上[30]。另外，其和金屬表面的優異粘合性能相似，雙膦酸鹽已被作為錨固劑，用于穩定納米粒子的空間結構[31]。

此外，雙膦酸鹽可以從體液中除去離子或分子。患有類風濕性關節炎或骨關節炎的患者的滑液中可以發現磷酸鈣晶體，評價了用雙膦酸鹽修飾的市售超順磁珠（Dynabeads?My One?）從疑似骨關節炎患者的滑液中析出磷酸鈣晶體的能力。有報道掃描電子顯微鏡（SEM）證實了晶體附著在磁珠上[32]。

5 結論與展望

在過去幾十年中，雙膦酸鹽由于其結構的特異性，被用于各種骨疾病的一線治療，但是由于其口服生物利用率低，因此，探索不同的給藥途徑，如肺、鼻和透皮等方式，以提高其生物利用度；為減少雙膦酸鹽副作用的發生，一些制劑新技術也正在不斷的研究和探索。雙膦酸鹽是理想的骨靶向劑，它們對骨組織中高代謝區域中的病理鈣化具有高選擇性親和力，目前正在開發針對轉移性骨病的骨靶向的治療。因此，將化療藥物靶向骨組織具有廣闊的前景。此外。雙膦酸鹽作為涂層劑、錨固劑、造影劑等也被廣泛應用于骨相關疾病的治療、成像等方面的研究。將來，雙膦酸鹽與核因子-κB 配體的受體激活劑的單克隆抗體聯合治療骨質疏松癥也不無可能。目前，用于該目的的第一抗體已經在市場上銷售。

雙膦酸鹽除了具有抗破骨細胞的作用外，還具有抗腫瘤的作用，盡管目前研究還處于實驗室階段，但是隨著研究的不斷深入，其必將在醫藥領域和臨床研究等方面有著廣闊的發展前景。