慢性傷口細菌生物膜管理的研究進展

鐘果玉 譚惠儀 葉雪梅

慢性傷口也稱慢性難愈性創面,目前對于其定義未達成統一的共識，傷口愈合學會對其定義：各種內在或外在因素影響下，無法通過正常、有序、及時的修復過程達到生理解剖和功能上的完整狀態的傷口，關于時間的分界為4周未愈合的傷口[1-2]。隨著社會人口老齡化，慢性傷口也呈老齡化趨勢且數目日益增長，慢性傷口的遷延不愈不僅對患者的身心造成負面影響，還給社會帶來醫療經濟負擔。據統計[2]，帶來慢性傷口中細菌生物膜普遍存在，是引起傷口延遲愈合的重要因素。因此認識生物膜、掌握其臨床特征、實施針對性的傷口管理，對促進慢性傷口愈合具有重大意義。

1 生物膜定義及概述

生物膜[3]被定義為微生物（細菌和真菌）構成的復雜的、動態的微生物群落，能合成并分泌一種胞外多糖蛋白復合物多聚物( EPS）使包裹的微生物相互粘連并聚集形成膜狀物質，不可逆地附著于創面上。 Malone等[4]于2017年結合生物膜體內外證據共性，將其簡化定義為：對于治療和宿主防御具有耐受性的細菌集合。生物膜的形成機制復雜[5]，涉及到傷口表面、微生物和EPS之間復雜而動態的相互作用，使其對抗生素和宿主免疫反應表現出顯著的耐受性，延長了傷口愈合時間。

2 早期識別診斷細菌性生物膜

2.1 細菌生物膜臨床識別

2.1.1 宏觀識別 據大量的臨床實踐及實驗的腐肉相鑒別，根據歐美壓瘡專家咨詢組制定的臨床實踐指南[3]中提出腐肉一般為黃色、黏稠、柔軟不透明的疏松或穩定附著于傷口的物質；創面上的生物膜多為有光澤、凝膠狀的物質，除了外觀性狀的區別，國內外研究[6-7]還總結了兩點差異：一方面腐肉與創面基底部組織緊密連接相較細菌生物膜，需銳器徹底清創;另一方面腐肉對酶類或自溶性清創敷料較細菌生物膜敏感。但是憑借主觀的判斷缺乏客觀標準，可信度及準確度不高。

2.1.2 微觀檢測 由于生物膜的結構微小，難以用肉眼識別，臨床利用實驗顯微技術對傷口采集標本進行分析。雖然傷口組織活檢被視為細菌培養的金標準[3]，但是出于操作的侵入性及對人員的技術較高，實踐中并不常用。拭子培養最被提倡用于傷口的細菌培養，采用Levines拭子技術其細菌定性培養結果與組織活檢的結果基本一致[3]。除了傳統的培養方式，目前也采用現代分子生物技術，該技術是指通過對微生物染色體染色并分析其中的DNA序列鑒定微生物種類，如：變性梯度凝膠電泳（DGGE）,肽核酸-熒光原位雜交,聚合酶鏈反應等[8]。DGGE可分析出傷口微生物的數目,發現細菌培養未檢測出的細菌。Steven等[9]成功通過DGGE證明了傷口及周圍皮膚部位微生物的多樣性。但是因微生物的基因異質性，分子生物技術無法有效地切除微生物DNA條帶等局限性，分子生物技術僅僅檢測出部分微生物種類的結果。隨著生物信息學與計算機技術日新月異發展，這些技術將用于微生物的快速定性和定量分析，提高識別慢性傷口細菌生物膜感染的準確性和科學性，這是未來檢測細菌生物膜的新方向。但目前因操作的復雜性及高昂的費用，難以在臨床應用與推廣。

2.2 細菌生物膜的臨床診斷

2017年的國際共識[10]中提出，傷口出現以下5大特征，提示生物膜感染的可能性:創面延遲愈合；創面復發性感染；抗生素、抗菌劑使用無效；傷口大量滲液滲出；傷口有輕度慢性炎癥、紅腫、紅斑。另外Bianchi等[11]認為,檢測細菌生物膜的金標準是肽核酸-熒光原位雜交、共聚焦激光掃描顯微鏡或電子掃描顯微鏡等可視化技術。 Haesler等[12]認為，通過肉眼觀察，傷口表面的深層位置物質，因為低靈敏度尚不認為是生物膜的臨床指標。Johani等[13-14]證實，細菌生物膜經常存在于傷口的深部組織（平均50~70μm）表面且以厭氧菌為主，肉眼難以精確識別導致忽視對其處理干預，這也是慢性傷口延遲愈合或不愈合的重要因素。通常傷口出現生物膜感染特征之一時，建議在嚴格無菌操作條件下進行組織活檢或細菌培養，接著結合激光掃描共聚焦顯微技術，觀察包裹在細菌表面的胞外多糖物質，這是診斷細菌生物膜存在的重要陽性指征［9-10］。生物膜的臨床診斷工具是慢性傷口實施有效管理策略的最大障礙，但是目前未在細菌生物膜的臨床識別、診斷的金標準方面達成共識。

3 細菌生物膜的創面管理

3.1 基本傷口管理原則

慢性傷口生物膜的微生物多樣性，生物膜表型其耐藥性[15]是浮游細菌的10~1000倍，因此采用多種并行干預策略顯得尤為重要。根據一項全球調查[16]，在生物膜管理共識中提出，針對慢性傷口患者的整體護理和創面管理：在管理傷口生物膜感染時，常忽略患者抗感染能力下降的相關因素，應關注組織血氧供應、營養、血糖水平和水腫等整體情況；創面管理需考慮創面床的準備情況，包括清創、創面清潔、創面抗菌藥物管理和創面濕性平衡。

3.2 傷口床的準備

3.2.1 清創術 是一種由外科醫生或傷口專科護士操作，去除腐肉、失活和壞死組織、細菌生物膜等，以改善或促進傷口愈合的護理技術[17]。常見的清創方法為機械清創、銳器/外科清創、自溶清創和酶清創。 機械清創指利用機械力去除慢性傷口壞死組織的清創方法，最常見包括濕到干的敷料，水療（渦流）和傷口灌洗（脈沖式灌洗）等[3,17]。但是目前缺乏研究[18-19]證實機械清創能去除生物膜，所以臨床應用也逐漸減少。 Swanson等[16]提出在合理安全的情況下，外科和銳器清創是清除失活組織及生物膜的金標準，同時建議所有類型的傷口進行劇烈的清創（外科/銳器清創），凝血功能障礙及動脈性缺血性的傷口除外。清創將慢性傷口轉變為急性加速其愈合，雖然不能徹底清除細菌生物膜，但相對超過24 h成熟的生物膜，在清創24 h內未成熟的生物膜，對局部抗菌劑更加敏感[16]。自溶性清創[20]指利用封閉或半封閉敷料（類型包括透明膜、水凝膠或水膠體等），保持傷口濕潤，讓自身傷口滲液產生的內源性酶（如蛋白水解酶），去除傷口床的壞死組織。Miller等[21]以傷口凝膠為例，該凝膠通過活性降解EPS破壞生物膜基質，分解定植的細菌，同時提供濕潤的愈合環境來清除生物。自溶性清創患者一般無疼痛感，但是禁用于嚴重感染的傷口。在清除細菌生物膜的安全性、有效性方面，相比外科/銳器清創術，其他類型清創術缺乏高等級的證據支持，對此期待我國更多的學者開展相關量性研究，隨機對照試驗。

3.2.2 創面的清潔 指從傷口表面清除未黏附的炎性污染物，是促進傷口愈合、減少生物膜發展及成熟的必需過程。若僅僅清洗傷口表面，傷口無潛在的感染物，可以應用清水或等滲生理鹽水，但是生理鹽水對清除生物膜無效[3,22]。PerciVal等[22]證實，以濃縮的泊洛沙姆為基礎的表面活性劑，通過降低傷口床和清潔液之間的表面張力、化學極性，以破壞微生物黏附、去除傷口污染物，在生物膜管理中起著重要作用。Bellingeri等[23]的回顧性分析中，表面活性劑沖洗液為實驗組，相比對照組（林格液或生理鹽水），在下肢靜脈潰瘍愈合率的影響中，結果顯示，表面活性劑的愈合率高達97%。臨床應用傷口清潔劑時，必須權衡其對細胞的潛在毒性，由于缺乏檢測傷口清潔劑的標準方法，及表面活性劑分解細菌生物膜EPS能力的證據，因此目前難以闡明傷口清洗劑的安全性。

3.2.3 負壓創面療法（NPWT） 通過充分引流傷口滲液改變創面pH,溫度和濕度等微環境，有效去除細菌生物膜和控制感染[24]。早期應用NPWT可以預防生物膜形成，達到改善傷口的目的[25]。Topaz等[26]首次報道，NPWT結合局部氧療（TOT）簡稱NPWTO2新方法，利用-120 ~-150 mmHg（－15.99~－16.67kPa）的負壓值，2~3 L/min氧流量輸入傷口，治療厭氧菌獲得成功。蔣琪霞等[24]在32例慢性傷口觀察組中應用負壓創面療法(負壓值為-120 mmHg)與局部氧療（氧流量為3 L/min）的干預方式，3個月內治愈率為87.5%，得出NPWTO2在傷口中應用可以控制感染、清除生物膜、改善創面微環境，進而縮短傷口愈合時間。但是有研究[26]提出,NPWT在慢性傷口的局部可形成低氧環境，容易繼發厭氧菌感染，影響傷口愈合。

3.2.4 創面敷料的使用 敷料的選擇應基于標準的臨床參數而不是敷料的含銀量或釋放活性。①單一敷料：含銀敷料目前認為具有廣譜抗微生物的作用；含銀離子（5~10 mg/L）敷料[27]24 h內可以清除約90%的傷口生物膜，48 h內可完全去除；其局限性為銀離子可能對宿主細胞具有嚴重的細胞毒性作用以及潛在的副作用，皮膚良性但永久性藍灰色變色[28]。一項體外試驗[29]中應用1%磺胺嘧啶銀4 h的人成纖維細胞存活率僅18%，該結果證明其對皮膚創面的毒性作用。②多元性敷料：NGAD(next-generation antimicrobial dressig) 一種新型抗菌敷料液體傷口敷料由抗菌劑與表面活性劑組成，Walker等[30]通過非隨機對照試驗中評估113名患者,其中74%的患者懷疑有生物膜，NGAD平均干預4周后,傷口改善率為94.7%（107例）。不足之處，目前還缺乏建立針對含銀及其他創面敷料安全性、有效性的體內模型或研究證據。

3.3 局部抗菌藥物的管理

目前無證據支持治療傷口相關感染時使用全身抗生素能預防生物膜感染[31]。理想的抗菌劑應具有廣譜性，迅速持久到達創面床，在滲出液中仍有效的活性，細菌產生耐藥性低，無全身吸收。工程蜂蜜是一種公認的傷口護理劑，Oryan等[32]就蜂蜜對傷口愈合的治療作用進行論述，結合25項臨床研究中對不同所有傷口類型（慢性傷口在內）使用不同的蜂蜜，得出了醫用蜂蜜促進傷口的愈合，減少了瘢痕的形成。其他抗菌劑：20%冰醋酸、卡地姆碘、膠原酶等。局部抗菌藥物的應用減少慢性傷口感染的風險及細菌耐藥性[33]。當傷口感染區域擴散到傷口邊界涉及骨骼或深層組織及全身時才針對性選擇抗生素。目前還缺乏足夠的文獻和臨床研究數據支持抗菌藥物在生物膜中的作用及機制，未來醫務人員可就此方面進行深入研究，將為日后生物膜的臨床治療帶來極大改觀。

4 細菌生物膜最新輔助療法

4.1 納米材料

近年來，大多數金屬基納米材料，不僅通過活性氧來滅活細菌，而且同時釋放具有抗菌活性的納米粒子，殺滅病原菌，如銀納米顆粒( AgNPs) 。AgNPs作為生物膜靶向劑穿透生物膜并對多種細菌的生物膜治療有效[34]， 不僅顯著抑制和殺死浮游細菌，還有效阻止生物膜的形成，破壞生物膜結構。研究發現[15]，低濃度的AgNPs暴露導致成熟生物膜生長遲緩，高濃度(18ug/ml)AgNPs完全阻止生物膜的形成。Su等[28]在體外試驗及動物模型中，利用可生物降解納米纖維敷料，通過局部傳遞抗菌肽再結合清創治療，不僅有效清除慢性創面生物膜，還對組織無明顯的細胞毒性作用。隨著治療生物膜材料和納米技術的發展，使生物膜靶向工程成為可能，其中納米顆粒提供了具有研究前景的治療平臺，有望減少抗生素的使用和細菌的耐藥性。

4.2 間充質干細胞

間充質干細胞( MSCs)是一種存在于骨髓，脂肪組織等多部位可自我更新的多功能細胞，可以通過直接分泌抗菌肽或間接調節宿主免疫反應來達到抗菌和抑制炎癥反應作用。目前動物實驗[35]中利用MSCs療法與抗生素相結合的創面生物膜更有效,有望成為治療慢性傷口感染的有效工具。但是仍需要更多的體內研究，直接測定其對傷口生物膜管理的影響。

4.3 其他輔助干預

噬菌體[36]是一種針對細菌的病毒，作為選擇特異性的抗菌劑，聯合蜂蜜或清創術在體內外模型中的應用均有效去除生物膜，未來臨床應用中可能是一種有效的輔助手段。益生菌、抗生素光動力學及無接觸低頻超聲波等新技術均為細菌生物膜的管理策略提供了新的方向。

5 展望

細菌生物膜在慢性傷口領域的研究日益引起人們廣泛關注，如何識別和診斷細菌生物膜，為慢性傷口患者提供有效的、創面管理成為關鍵，因此通過查閱相關國內外文獻總結：目前識別及清除細菌生物膜仍處于探索階段，染色法和現代顯微技術的發展使細菌生物膜的定位與識別成為可能；目前國際上管理細菌生物膜的趨勢是兩種及以上干預方式的聯合應用（如清創+局部抗菌劑、清創+創面敷料等），促進傷口愈合提高患者生存質量。雖然新的抗細菌生物膜技術，在體外模型的應用取得了進展,但是其存在局限性：第一，許多用于慢性傷口管理的傷口治療決策，特別是細菌生物膜方面，缺乏大量強有力的證據支撐及臨床的隨機對照驗證；第二，對生物膜的研究大多仍局限于體外及動物實驗，使用“未成熟生物膜”進行干預，缺乏臨床評估及標準的傷口護理，得出的相關性研究結論令人質疑；第三，通過對慢性傷口患者的整體評估與傷口局部評估有機結合，進一步探索適用于慢性傷口患者，清除細菌生物膜的有效性、安全性、經濟性的創面干預策略，未來可進行大樣本的對照試驗和多中心研究，為臨床工作者提供證據和推廣應用，改善慢性傷口患者結局。