高效絮凝菌的分離鑒定及其絮凝條件的優化

林映津 陳倩 曾小妹 謝貽冬 付洋

摘要 采用微生物分離純化技術從底泥樣品中篩選到一株絮凝菌，通過目標菌株的形態學特征和16S rRNA序列分析以鑒定其種屬，并對其發酵條件和絮凝條件進行優化。結果表明，XN1-4為黏質沙雷氏菌;XN1-4在發酵28 h后其發酵液的絮凝效果最好。菌株XN1-4的最佳培養條件為培養基初始pH 5.0、培養溫度25? ℃、搖床轉速150 r/min;最佳絮凝條件為發酵液投加量4%、助凝劑投加量4%。在最佳絮凝條件下，XN1-4的絮凝率達到98%，且絮凝活性成分主要存在于菌體本身。

關鍵詞 絮凝菌;分離鑒定;培養條件;絮凝條件;優化

中圖分類號 X52? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）24-0006-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.24.002

Isolation and Identification of High-efficiency Flocculating Bacteria and Optimization of Flocculation Conditions

LIN Ying-jin1，2，CHEN Qian1，ZENG Xiao-mei1，2 et al （1.Huachuan Technology Co.，Ltd.，Fuzhou，Fujian 350008;2.Fujian Engineering and Research Center of Ecological Restoration of Lake，Reseavoir & River Basin，Fuzhou，Fujian 350008）

Abstract Using microbial separation and purification technology，a flocculating bacteria was isolated from the sediment samples.The bacterial species were identified characterized based on morphological characteristics and 16S rRNA sequence analysis，and its fermentation and flocculation conditions were optimized.The results showed that the flocculating bacteria XN1-4 belonged to Serratia marcescens; strain XN1-4 had the best flocculation effect in the fermentation broth after cultured for 28 h.The optimal culture conditions of strain XN1-4 were the initial pH of the medium 5.0，the culture temperature of 25? ℃，and the rotating speed of the shaker 150 r/min;the optimal flocculation conditions were the fermentation broth dosage of 4% and the coagulant dosage of 4%.Under the optimal flocculation conditions，the flocculation rate of XN1-4 reached 98%，and the flocculating active components mainly existed in the bacteria itself.

Key words Flocculating bacteria;Isolation and identification;Culture conditions;Flocculation conditions;Optimization

基金項目 福州市科技計劃項目（2019-S-110）。

作者簡介 林映津（1965—），男，福建福州人，工程師，從事水污染生態與修復方面研究。

收稿日期 2021-04-20

隨著社會經濟的快速發展，人們生活水平的不斷提高，日益凸顯的河湖生態環境問題也越來越受到關注和重視。雖然，目前也采取了許多截污措施，但由于人口及工業的快速發展，水體富營養化等水生態環境問題仍然日益嚴重[1-3]，許多地方的河流及湖泊均出現了不同程度的水體富營養化現象，藻類大量繁殖、水體透明度和溶解氧都明顯降低[4]，不僅嚴重影響了水體生態系統，而且嚴重危害了人類的身心健康[5]。因此，高效修復富營養化等被破壞的水體成為亟待解決的生態環境問題。然而，目前對富營養化等受到破壞的水體多采用物理或化學等方法，效果并不十分理想，并且容易產生二次污染等問題，因此，迫切需要尋找一種高效且不產生二次污染等問題的方法。

微生物絮凝劑是一類微生物在生長繁殖過程中代謝分泌產生的一種高分子活性物質[6]，如蛋白質、多糖、脂類和核酸等[7-8]，能夠絮凝、沉降水體中的懸浮顆粒、色素等物質，具有安全高效、綠色環保、可生物降解等優點，不會引起二次污染[9-11]。陸洪省等[12]將絮凝菌SKDXN-1應用于富營養化水體的治理，該菌株處理富營養化水體10 d后，水中葉綠素a去除顯著，去除率達89.10%，對水體總氮、總磷和COD的去除率分別為10.5%、15.6%和44.5%，具有一定的生態修復效果。但由于微生物絮凝劑在實際水污染治理應用方面存在用量大、成本高的問題[13]，目前并沒有被廣泛應用于水體生態修復中，因此篩選高效絮凝劑產生菌、提高絮凝劑的絮凝效果、降低絮凝劑用量[14-15]，是該領域當前研究的重點[16-17]。

目前，絮凝劑產生菌大多是從活性污泥、土壤、河流、深海等環境中篩選而來[18-19]，以湖泊底泥為對象篩選絮凝菌的研究較少報道[20]。筆者以湖泊底泥為篩選對象，分離篩選到一株絮凝菌，通過形態學、生理生化以及16S rRNA進行菌種鑒定，并研究絮凝菌的最適培養條件和絮凝條件，為絮凝菌在水體生態修復中的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

現場利用柱狀底泥采樣器采集漳州市峰頭水庫淺層底泥，準確稱取10 g淺層底泥樣品于無菌的250 mL三角瓶中，加入適量無菌水和玻璃珠，在旋渦振蕩器上充分振蕩均勻。

1.2 培養基

富集培養基：牛肉膏 5 g、 蛋白胨 10 g、 氯化鈉10 g，溶于蒸餾水中，調pH 7.2～7.4，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

分離培養基：在富集培養基的基礎上加1.5% 的瓊脂。通用發酵培養基：葡萄糖 20.0 g、KH2PO4 2.0 g、K2HPO4? 5.0 g、 （NH4）2SO4 0.2 g、 NaCl? 0.1 g、脲0.5 g、酵母膏 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g，溶于蒸餾水中，調pH 7.2～7.4，定容至1 000 mL，115 ℃滅菌30 min。

1.3 菌種富集與分離純化

吸取10 mL充分混勻的樣品溶液于裝有100 mL富集培養基的 250 mL 三角瓶中， 30? ℃ 150 r/min 振蕩培養48 h，待培養基渾濁后，再次轉移10 mL溶液至新的富集培養基中，同等條件下振蕩培養48 h，如此重復富集2～3次。取最終富集培養液，梯度稀釋至1×10-6、1×10-7、1×10-8，分別取100 μL涂布于分離培養基上，30 ℃培養48 h。挑取表面光滑黏稠的單菌落， 于分離培養基上多次平板劃線純化直至得到單菌落，斜面保存備用。

1.4 高效絮凝菌的篩選

分別挑取已分離純化的各菌株接種于裝有100 mL 通用發酵培養基中，在 30? ℃、150 r/min 的條件下振蕩培養 48 h后， 吸取2 mL菌液測定發酵液的絮凝活性，每次測定重復 3 次， 取平均值。

絮凝活性測定方法：取2 mL菌液、2 mL質量分數為1%的CaCl2溶液加入46? mL 0.4 g高嶺土懸浮液中，置于磁力攪拌機上攪拌，控制條件為200 r/min下快攪1 min，然后100 r/min下慢攪3 min。靜沉5 min，吸取上清液于550 nm下測定吸光度，同時以未接種的發酵培養基作為空白對照，確定菌株發酵液的絮凝活性。按照公式（1）計算絮凝率。

絮凝率=（A-B）/A×100%（1）

式中，A為未接種發酵培養基的OD550，B為樣品的OD550，以蒸餾水做參比。

1.5 絮凝菌的鑒定

1.5.1 形態學鑒定和生化鑒定。

將篩選得到的菌種接種于營養瓊脂培養基上， 在 30? ℃ 下培養 48 h， 對菌株進行革蘭氏染色， 油鏡下觀察菌體形態。用富集培養基將菌株在 30 ℃ 下培養至對數生長期，將菌液按照無菌操作技術接入細菌生化鑒定管中， 30 ℃、150 r/min 條件下振蕩培養 48 h 后觀察記錄結果。

1.5.2 16S rRNA基因序列的測定分析。

使用DNA提取試劑盒提取目標菌株的基因組DNA，采用16S rRNA基因通用引物擴增獲得PCR產物，經電泳檢測后，直接交由上海生工進行測序，要求雙向測通。所得測序結果提交GenBank進行Blast序列比對分析。

1.6 絮凝菌的生長特性分析

將篩選獲得的絮凝菌在富集培養基中活化培養24 h，作為種子液。取2%菌種液轉接至通用發酵培養基中，培養溫度為30 ℃，搖床轉速為150 r/min，每隔4 h取樣1次，取樣時長為48 h，測定發酵液中的細菌密度（OD600）和絮凝率，以未接菌種液的培養液為對照。繪制菌株的生長曲線及絮凝率變化曲線，以確定最佳的發酵時間。

1.7 絮凝活性分布

吸取30 mL發酵液于50 mL離心管中，在5 000 r/min離心10 min，移取上清液至新的離心管中，用蒸餾水洗滌菌體沉淀2次，再用等體積的蒸餾水重懸菌體，制成細胞懸浮液。分別測定發酵原液（含細胞）、 上清液以及細胞懸浮液的絮凝率。

1.8 發酵條件優化

在其他培養條件不變（培養基初始pH為7.0，培養溫度為30 ℃，轉速為150 r/min）的基礎上，以其中的一個單因素為變量，發酵培養48 h后取樣測定絮凝率，分析不同培養條件對絮凝活性的影響，以得到目標菌株的最佳培養條件。①培養基初始pH：采用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH，將初始pH分別調為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。②培養溫度：在上述已得到的最佳培養條件下，設定不同培養溫度（20、25、30、35、40 ℃）。③轉速：在上述已得到的最佳培養條件下，設定不同搖床轉速（100、120、150、180、200 r/min）。

1.9 絮凝條件優化

在最佳培養條件下，探討不同絮凝條件對目標菌株絮凝活性的影響，以確定最佳絮凝條件。①發酵液投加量：設定不同體積分數的發酵液投加量（1%、2%、3%、4%、5%）。②助凝劑投加量：設定不同體積分數的助凝劑投加量（1%、2%、3%、4%、5%）。

2 結果與分析

2.1 絮凝菌種篩選結果

經富集、分離、純化，從底泥樣品中共分離出20株菌落表面光滑黏稠的菌株，其中有17株具有絮凝活性。由表1可知，XN1-4、XN2-5、XN3-1、XN3-4這4株的初篩絮凝率均超過30%，可作為復篩備用菌株。

將表1中篩出的4株絮凝活性較高的菌株進行復篩，測定絮凝率，每株重復3次，結果發現，

XN1-4、XN2-5、XN3-1、XN3-4的絮凝率分別為86.15%、42.60%、52.37%、57.14%，由此得到1株具有穩定高絮凝活性的微生物XN1-4，將其進行保種。

2.2 絮凝菌的鑒定

2.2.1 形態學和生理生化特征。

對菌株XN1-4進行了形態學和生理特征鑒定，結果見表2和圖1。經檢索常見細菌系統鑒定手冊、伯杰細菌鑒定手冊，XN1-4菌株的形態和生理生化特征與沙雷氏菌屬一致。

2.2.2 16S rRNA基因序列的測定分析。

絮凝菌XN1-4的基因組DNA經提取后進行16S rRNA全長擴增，瓊脂糖凝膠電泳結果見圖2。擴增的16S rRNA片段經測序后得到長度為1 441 bp的基因序列，將基因序列提交GenBank進行Blast分析比對，結果顯示（圖3），XN1-4與黏質沙雷氏菌UMH2（Serratia marcescens strain UMH2）的序列有99%的同源性。根據菌株的生理生化試驗結果和16S rRNA基因序列的測定結果，可以鑒定其為黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）。

2.3 絮凝菌的生長特性

從圖4可以看出，XN1-4菌體均在接種的4 h后進入對數生長期，并且一直持續到20 h，接種后第20小時開始進入穩定期，一直持續到48 h。同時，XN1-4菌體在接種后的2 h開始合成絮凝物質，但此時菌體密度較低，因此生成的絮凝物質較少，絮凝率較低;隨著培養時間的延長，絮凝率不斷增加，其中，XN1-4菌體在接種的第28小時達到最大值，此時絮凝率為94.67%，之后絮凝率開始略微下降。這是由于發酵體系中產生的解絮凝酶和細菌內源呼吸引起的。由此可知，菌株XN1-4的最佳發酵時間為28 h。

2.4 絮凝活性分布

分別測定了菌株的發酵原液、上清液以及菌體細胞懸浮液的絮凝率，結果見圖5。從圖5可以看出，XN1-4菌體細胞懸浮液的絮凝率為98.14%，而上清液的絮凝率僅只有19.69%，這表明絮凝菌XN1-4的絮凝活性成分主要分布在菌體細胞本身，分泌到細胞外的活性成分很少。

2.5 發酵條件優化

2.5.1 培養基初始pH對絮凝效果的影響。

由圖6可知，XN1-4絮凝生長的pH適應范圍為4.0～9.0，當發酵培養基的初始pH為4.0～6.0時，菌體的絮凝活性較高;當初始pH達到5.0時，菌體的絮凝率最高，達96.45%;而當初始pH超過6.0時，隨著初始pH不斷增加，絮凝活性也隨之降低。因此，培養基初始pH設定為5.0。

2.5.2 培養溫度對絮凝效果的影響。

由圖7可知，當XN1-4的培養溫度為20～25 ℃時，隨著溫度的升高，菌株的絮凝率也升高，溫度處于25 ℃時的絮凝率達到最高，為97.63%;而超過這一范圍，隨著溫度的繼續升高，絮凝率反而不斷下降。因此，XN1-4的最適發酵溫度為25 ℃。

2.5.3 轉速對絮凝效果的影響

由圖8可知，當搖床的轉速為100～150 r/min時，隨著轉速的增加，XN1-4發酵液的絮凝率不斷增加;轉速達到150 r/min時，發酵液的絮凝活性最大，絮凝率為97.61%;而當轉速由150 r/min繼續增加到200 r/min 時，XN1-4的絮凝率卻開始下降。因此，搖床的最適轉速為150 r/min。

2.6 絮凝條件優化

2.6.1 發酵液投加量對絮凝效果的影響。

由圖9可知，絮凝菌的發酵液存在最適的投加量，當發酵液投加量處于1%～4%時，XN1-4菌株的絮凝率隨著投加量的增加而逐漸增大，XN1-4在投加量為4%時，絮凝率達到最大（97.65%）;隨著投加量的繼續增加，絮凝率開始呈現下降趨勢。因此，XN1-4菌株發酵液的最適投加量為4%。

2.6.2 助凝劑投加量對絮凝效果的影響。

由圖10可知，當助凝劑CaCl2的投加量為1%～4%時，XN1-4的絮凝率隨著投加量的增加而有明顯的增大，當CaCl2的投加量達到4%時，菌株的絮凝率達到最大，為97.60%;當CaCl2的投加量繼續增大時，菌株的絮凝率開始輕微下降。因此，助凝劑的最適投加量為4%。

3 討論

目前，從自然界中分離所得的絮凝菌多為紅平紅球菌（Rhodococcus erythopolis）、芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus sp.）、假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、土壤桿菌屬（Agrobacterium sp.）、不動桿菌屬（Acinetobacter sp.）、曲霉屬（Aspergillus sp.）等[21-23]。該研究從湖泊底泥中分離得到一株具有高效絮凝活性的菌株XN1-4，并經過形態學特征、 生理生化反應及 16S rRNA 序列同源性比對， 鑒定該菌為黏質沙雷氏菌。

黏質沙雷氏菌屬于革蘭氏陰性菌，兼性厭氧，在 25～30 ℃條件下培養，可形成圓形、光滑、不透明的菌落，該研究篩選到的黏質沙雷氏菌其活性成分主要分布在菌體細胞本身，這與酵母、放線菌等微生物的絮凝機理類似，均是直接利用微生物細胞作為絮凝劑參與絮凝反應[24]。此外，黏質沙雷氏菌的次生代謝產物——靈菌紅素不僅具有抗菌、抗瘧疾、抗腫瘤等生理活性[25]，而且具有強烈的細胞溶解酶活性[26]，對水華魚腥藻、銅綠微囊藻、微小平裂藻和赤潮異彎藻有很高的致死性，并且在強光下可完全分解，不產生二次污染，因此是應急控藻和富營養化水體生態修復的優良選擇[27-32]。

研究表明，微生物的培養條件對菌體細胞生長以及絮凝活性物質的生成有一定的影響，如改變絮凝菌的培養溫度、培養基初始pH和搖床轉速等條件，均會改變絮凝活性物質的合成過程，從而影響絮凝效果。

培養基初始pH不僅會影響菌體細胞表面的電荷狀態，還會影響培養基中有機物的離子化，導致有機物與微生物細胞表面的吸附作用發生變化，進而影響微生物對有機物的利用。同時，在微生物合成絮凝物質中起催化作用的酶只有在最適pH條件下才能發揮其最大的催化活性[33]。該研究中，菌株XN1-4在培養基初始pH為4～6時，均能保持90%以上的絮凝活性，當初始pH達到5.0時的絮凝效果最好。

培養基的溫度主要通過影響細胞內酶活性及其催化反應的速率來影響菌體絮凝物質的合成，從而影響絮凝效果。溫度較低時，微生物生長代謝緩慢，生物酶活性降低，影響了絮凝物質的生成;而溫度較高時，可能破壞了酶蛋白的結構和功能，使酶活降低或失活，從而影響細胞代謝進而影響絮凝物質的生成，降低絮凝活性[34]。該研究中，菌株XN1-4的培養溫度為25～35 ℃時，菌株能保持75%以上的絮凝活性，其最適培養溫度是25 ℃。

搖床轉速主要是通過影響微生物的耗氧量來影響微生物的生長繁殖和絮凝物質的合成。合適的轉速可以滿足微生物對氧氣的需求，也能防止菌體因黏附在一起，而影響正常的生長繁殖和絮凝物質的生成。該研究中，當搖床轉速達到150 r/min時，菌株XN1-4的絮凝活性最大，但超過這一轉速后，絮凝率卻開始下降，這與吳敬榮等[35]的研究結果一致，其主要原因是轉速過高時，培養基中溶解氧的增加使微生物細胞的生長繁殖速度加快，消耗了大量的營養物質，從而降低絮凝物質的合成，導致絮凝活性降低。

此外，絮凝菌的絮凝活性還受到發酵條件的影響，該研究針對絮凝菌發酵液的投加量和助凝劑的投加量進行了優化。發酵液作為絮凝體系的主體，其投加量將直接影響最終的絮凝效果和處理成本。該研究中發酵液的最適投加量是4%，當發酵液投加量較少時，絮凝作用達不到最佳的效果;而當發酵液過量時，高分子物質將膠體粒子包裹起來，影響了體系中脫穩作用和凝聚作用，使得絮凝效果變差[36]。在絮凝體系中添加適量的助凝劑可以有效提升絮凝效果，這是因為助凝劑CaCl2中的Ca2+可以中和膠體粒子表面的負電荷，減少膠體粒子之間的作用力，絮凝劑與膠體粒子碰撞之后能快速降低膠體表面的電位，使得膠體粒子脫穩并形成較大聚團而沉降下來。該試驗中助凝劑CaCl2的投加量達到4%時，絮凝率最大;當CaCl2的投加量繼續增大時，體系中過多的Ca2+離子會搶占絮凝分子的結合位點，使絮凝分子不能夠與膠體粒子結合從而降低了絮凝效果[37-38]。

4 結論

該研究從漳州峰頭水庫底泥中分離到一株具有高絮凝活性的菌株XN1-4，經鑒定為黏質沙雷氏菌，其活性成分主要分布在菌體細胞本身，最佳培養條件為培養基初始pH 5.0、培養溫度25 ℃、搖床轉速150 r/min;最佳絮凝條件為發酵液投加量4%、助凝劑投加量4%，在此條件下，XN1-4的絮凝率可達98%。該研究不僅為研究絮凝微生物提供了良好的菌種資源，同時也為絮凝菌在水體生態修復中的應用奠定了基礎。

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