中醫藥干預肺癌細胞自噬的研究現狀

馬翔 馬佳樂 張珊珊

2015年至2018年，肺癌連續4年位居我國發病率和死亡率第一[1]。2018年美國癌癥協會一項目顯示，在世界所有癌癥患者中，肺癌患者的總數占到1/8[2]。肺癌的病因與多種因素有關，包括遺傳、職業環境接觸、吸煙及大氣污染等。雖然可以通過手術、放化療、介入、靶向、中醫等方式治療，但預后仍較差，死亡率仍然很高，因此，需要探索更為精準的分子靶向治療[3]。細胞自噬是細胞內的一種降解途徑，可以參與細胞的代謝、免疫，維持細胞的穩態[4]。近年來，多項研究表明，細胞自噬在腫瘤的發生發展過程中發揮了非常重要的作用，細胞自噬激活可清除變形、錯誤折疊的蛋白，維持穩定的細胞內環境，抑制肺癌細胞增殖，促進凋亡[5]；而且，自噬機制對癌細胞具有保護作用，使癌細胞具有在缺氧、饑餓環境中獲取營養的能力[6]。因此，細胞自噬機制對腫瘤細胞具有雙向作用，適當的調控自噬，以發揮抗腫瘤作用，對癌癥的治療具有重要意義。現階段，中醫藥干預肺癌細胞自噬的研究日益增多，現將相關研究做一綜述，為后續中醫藥防治肺癌的研究提供一定參考。

1 中醫藥對肺癌細胞自噬相關蛋白的研究

1.1 ATG8/LC3

LC3是研究最早的ATG8同源蛋白質，包括LC3A、LC3B、LC3B2及LC3C[7]。LC3在半胱氨酸蛋白酶 Atg4的作用下暴露出甘氨酸(glycine，Gly)殘基形成LC3-Ⅰ，接著被E1泛素活化酶ATG7激活，與脂分子磷脂酰乙醇胺結合形成為LC3-II[8]。作為公認的自噬的標記基因，LC3-Ⅱ可以反映細胞中自噬水平的強弱，且在肺癌患者中的LC3B表達明顯下降[9]。

周曉芳等[10]發現，苦參堿可上調LC3-Ⅱ的表達，促進自噬體形成，進而抑制肺癌A549細胞。鄭心等[11]發現，肺抑瘤膏能明顯抑制EGFR野生型Lewis 肺癌小鼠模型移植瘤的生長，增加自噬標志蛋白LC3表達。王林等[12]發現，黃芩苷可提高A549肺癌細胞中LC3-II的表達，增加癌細胞中自噬溶酶體的數量，其影響與黃芩苷濃度呈正相關。王程燕等[13]發現，芪冬寧方可提高肺癌A549、NCI-H460細胞的LC3B，并降低自噬相關蛋白p62水平，與藥物濃度呈依賴性關系。

1.2 p62

選擇性自噬受體蛋白p62是泛素化蛋白和自噬體之間的樞紐，可對底物進行選擇性識別、運輸[14]。當細胞內錯誤折疊蛋白被泛素化時，p62可與這些泛素化蛋白及LC3-II結合，然后運往自噬體進行降解[15]。在自噬發生時，P62蛋白在細胞內被利用，其表達降低，與自噬呈負相關。研究顯示，在肺癌患者中P62蛋白的表達出現累積[12]。

溫文浩等[16]報道了丹參酮TIIA可上調LC3-Ⅱ，抑制p62，誘導肺癌A549細胞發生自噬。張云珍等[17]研究發現，在A549肺癌細胞加入白藜蘆醇50 μmol/L處理后可形成較多的自噬體，p62蛋白水平下調，LC3Ⅱ/Ⅰ上調，此外，白藜蘆醇可使凋亡相關蛋白水平提高，表明白藜蘆醇可誘導細胞自噬及凋亡。邵鑫等[18]將不同濃度的苯甲酰烏頭原堿處理肺癌A549細胞后發現，p62 mRNA和蛋白下降、LC3 mRNA上調，改變程度與苯甲酰烏頭原堿的濃度密切相關，且調控凋亡蛋白的表達，呈濃度依賴性。陳姝瑾等[19]發現，熊果酸可降低p62蛋白水平，提高LC3Ⅱ/Ⅰ比值，促進癌細胞自噬，隨著濃度升高，熊果酸對肺癌細胞的抑制作用也相應增強。龐歆橋等[20]發現，黃芪甲苷具有下調P62、上調LC3I/LC3II比值的作用，聯合貝伐單抗可增強抗肺癌細胞的作用。

1.3 ATG5-ATG12

ATG5是最常見的促表達變化的自噬因子。ATG5-ATG12復合物可與ATG16L1結合形成新的復合物，通過特異性的方式促進脂質和蛋白結合[21]。在自噬發生時, 分離膜外側的ATG5-ATG12-ATG16L復合物可以提供位點給ATG8/LC3[22]。研究表明，對ATG5進行干預可影響肺癌 A549 細胞的自噬水平[23]。

王碩等[24]研究發現，中劑量香草扶正合劑顯著上調ATG5、LC3B、Beclin1 mRNA和蛋白的表達水平，提高小鼠的體質量，且較化療組更明顯，提示香草扶正合劑具有較強的抗肺癌作用，與誘導細胞自噬有一定關系。程建超等[25]通過應用芪玉三龍湯干預肺癌移植瘤小鼠發現，芪玉三龍湯可使ATG5蛋白表達升高，促進ATG5 mRNA轉錄，阻礙小鼠肺部腫瘤的生長。羅敏等[26]報道了熊果酸促進PC9肺癌細胞中ATG5、LC3-Ⅱ表達及癌細胞中自噬泡形成，誘導細胞自噬，從而抑制癌細胞增殖。

1.4 ATG6/Beclin-1

ATG6的同系物Beclin-1可通過進化保守區(ECD)與Ⅲ型P13K形成復合物，調動相關蛋白質參與自噬，并對其它ATG的定位發揮引導作用[27]。根據不同分子的作用，Beclin1-PI3K-ATG14復合體對自噬會起到誘導或抑制雙向影響；而Beclin1-PI3K-UVRAG復合體則有助于自噬體成熟[28]。

WANG等[29]報道了銀杏內酯B介導的肺癌細胞自噬依賴于Beclin-1蛋白的表達，同時發現細胞自噬可抑制NLRP3炎性小體，進而抑制腫瘤細胞增殖。盧政霞等[30]研究證實，土槿皮乙酸作用可提高肺癌A146細胞中Beclin-1的水平，促進LC3從Ⅰ型轉化為Ⅱ型，阻止腫瘤細胞生長。張剛等[31]發現，在非小細胞肺癌A546細胞株內加入左旋一葉萩堿處理后，肺癌細胞Beclin-1 mRNA水平提升，且與藥物濃度成正相關。袁嘉瑞等[32]發現，將麥冬醇提物可使A549肺癌細胞的Beclin-1 mRNA水平升高，促進自噬體形成。龐晨等[33]等研究表明，高、中劑量的鮮鐵皮石斛可使肺腺癌裸鼠移植瘤中的Beclin-1 mRNA表達增高，以抑制腫瘤生長。趙楠等[34]發現，中藥提取物雷公藤紅素可提高肺癌細胞中LC3B、Beclin 1 mRNA和蛋白表達，通過自噬以抑制肺癌細胞的增殖及侵襲。

在自噬體形成過程中，LC3、p62、Beclin-1、ATG5等發揮著重要作用，它們是肺癌診斷、精準治療的新型標志物。以自噬相關基因、蛋白為靶點，對中醫藥抗腫瘤新藥的研制具有重要意義。目前，中醫藥相關研究多集中于LC3、p62、Beclin-1等自噬蛋白，且大多為中藥活性成分，對ATG5-ATG12及Unc-51樣自噬激活激酶1等自噬相關蛋白缺乏中醫藥全面、深入的研究。中醫藥對自噬基因干預方向的研究仍相對薄弱，肺癌的形成及治療機制尚未完全闡明，還需繼續探索和不斷驗證。

2 中醫藥對肺癌細胞自噬相關信號通路的研究

2.1 磷脂肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphninositide3-kinase/protein kinase B/the mammalianta target of rapamycin，PI3K/Akt/mTOR)信號通路

細胞自噬與PI3K/Akt/mTOR通路密切相關，當營養充足時，在PI3K與Akt的作用下，mTOR被激活，形成mTORC1復合體，阻礙ULK1激活，使自噬受阻[35]；在營養不足時，mTORC1受到抑制，下調了mTORC1復合體的形成，激活ULK1，促進細胞自噬[36]。此外，AKT還可與Beclin-1結合誘導肺癌細胞發生自噬[37]。

陳春苗等[38]發現，低濃度的白藜蘆醇與順鉑聯用比單用順鉑可更明顯下調肺癌細胞中 PI3K、AKT、mTOR、p62的蛋白表達，上調LC3-II、Caspase3、Bax，提高自噬小體的數量，表明白藜蘆醇聯合順鉑可負向調控PI3K/Akt/mTOR通路，從而促進肺癌細胞調亡與自噬。而王雪林等[39]發現，黃芪多糖可降低PI3K、LC3B，上調Akt、p62水平，使肺癌細胞自噬體減少，抑制自噬，使肺癌細胞處于缺氧環境，阻斷其生長。周立江等[40]發現，肺積寧方可上調肺癌細胞Beclin-1、Atg5、LC3B-Ⅱ蛋白的表達，下調 mTOR、AKT、p-AKT蛋白水平，增加自噬小體的數量，誘導自噬以發揮抗癌作用。楊佩穎等[41]證實了在耐藥細胞株中消巖湯可以下調 AKT1 和 mTOR 基因的表達，進而干預AkT/mTOR通路抑制肺癌細胞的增殖。孟東雪等[42]發現高濃度扶正抑瘤湯處理A549肺癌細胞后，可下調p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR的表達，上調Beclin-1、LC3蛋白，促進肺癌細胞中自噬溶酶體形成，抑制肺癌細胞增殖，同時扶正抑瘤湯也可提高A549肺癌細胞的凋亡率。

PI3K/Akt/mTOR是經典的信號通路之一，多項研究均已證實中醫藥在干預PI3K/Akt/mTOR通路誘導自噬中的作用。miRNA可調控PI3K/Akt/mTOR信號通路，從而影響細胞自噬，中醫藥是否通過影響miRNA表達，調控PI3K/Akt/mTOR通路與自噬的發生，需要進一步深入研究。

2.2 p53蛋白/磷酸腺苷蛋白激酶/雷帕霉素靶蛋白(p53/AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin，p53/AMPK/mTOR)信號通路

p53是細胞自噬重要的調控因子，p53可誘導Sestrin1/2與AMPK的Thr172發生磷酸化或激活β1、β2 亞基，然后激活AMPK[43]。活化后的AMPK可磷酸化TOR1調節相關蛋白，降低mTORC1活性，或直接磷酸化ULK1，從而干預細胞自噬[44]。

LI等[45]研究證實，參皂苷代謝產物K可激活AMPK-mTOR和JNK信號通路，上調LC3II和Beclin-1表達，抑制p62表達水平，誘導非小細胞肺癌細胞自噬。該團隊進一步的研究表明，參皂苷代謝產物K可在一定程度上解除AMPK抑制劑、JNK抑制劑對肺癌細胞自噬的抑制作用。KIM等[46]發現，經黃芩處理后非小細胞肺癌細胞H358、H2087中，AMPK、P70-S6激酶的磷酸化水平升高，下游靶點S6K也被激活，LC3Ⅱ/Ⅰ表達也相應提高。而當抑制AMPK磷酸化時，黃芩的凋亡作用被抵消，提示黃芩誘導的自噬依賴于AMPK通路的激活。彭鵬等[47]發現，重樓皂苷Ⅰ與AMPK有著很強的親和力，可抑制蛋白酶對AMPK蛋白的分解，重樓皂苷Ⅰ通過激活 AMPK/mTOR 通路，提高AMPK蛋白磷酸化，誘導非小細胞肺癌(PC9、H460)自噬，起到抑制肺癌作用。文蘭香等[48]研究表明，中藥黃酮類槲皮素可活化AMPK/mTOR通路，調控p-AMPK/AMPK、p-mTOR/mTOR、p-S6K/S6K表達，上調LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白，而槲皮素聯合AMPK抑制劑則降低AMPK磷酸化，下調LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白，提示肺癌細胞自噬體形成與AMPK/mTOR通路的激活密切相關。

基于上述自噬相關信號通路的研究可見，mTOR是涉及較多的作用因子，對自噬具有負性調控作用。中醫藥抑制肺癌的相關研究可以mTOR為切入點，通過影響mTOR，調控相關信號通路，誘導自噬，為新藥創制提供思路。

2.3 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路

在MAPK通路中，細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular-signal regulated kinase，ERK)通路等可被RAS等磷酸化激活，進而參與細胞增殖、癌變等[49]。MAPK信號通路位于活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的下游，在誘導細胞凋亡和自噬中起重要作用[50]。

FAN等[51]報道了鴉膽子素D可上調肺癌細胞p-ERK、p-JNK表達，激活MAPK信號通路，從而提高ROS的水平，提高LC3-II/LC3-I比值，下調p62表達，促進自噬小體的形成。而經ROS清除劑預處理后，鴉膽子素D誘導自噬的作用則被抑制。SHEN等[52]研究證實，蘆薈大黃素通過激活MAPK信號通路，誘導細胞自噬，引發細胞凋亡，降低非小細胞肺癌細胞存活率，而與上述鴉膽子素D相同，蘆薈大黃素誘導的自噬為ROS依賴型，可被ROS清除劑NAC抑制。張雪琴等[53]報道了迭鞘石斛乙醚提取物可以促進肺癌細胞中RAS相關蛋白的表達，從而抑制肺癌細胞的增殖。王偉等[54]人通過研究發現，雷公藤甲素可上調 p-ERK/ERK 蛋白和LC3-Ⅱ蛋白表達，通過影響ERK蛋白磷酸化可誘導細胞自噬，ERK屬于MAPK家族，因此該團隊推測雷公藤甲素誘導的細胞自噬與MAPK通路相關。然而，一些研究發現，細胞自噬對肺癌細胞起保護作用。WANG等[55]用不同濃度的白藜蘆醇對肺癌A549和H1299細胞進行處理發現，白藜蘆醇可上調Beclin-1、LC3 II/I表達，誘導自噬，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可抑制自噬，促進癌細胞凋亡，提示白藜蘆醇誘導的自噬可能對肺癌細胞起保護作用，進一步的研究發現白藜蘆醇可抑制p38-MAPK通路激活，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。

信號通路是細胞外信號分子向內傳遞的途徑，多種信號通路之間相互影響，并非單一發揮作用，在對信號通路的影響上，中藥有獨特優勢，可以多靶點、多通路發揮作用，中醫藥干預自噬相關信號通路的研究將是今后的研究熱點。現階段基于自噬相關信號通路的研究多集中在中草藥主要活性成分，而中醫藥復方、中醫外治等相關研究較少，深入研究中醫藥經典方劑及外治法通過調控自噬相關通路，影響肺癌細胞增殖、侵襲，為臨床應用提供指導。

3 中醫藥對線粒體自噬的研究

當細胞耗氧量增多，線粒體氧化磷酸化會被抑制，導致ROS累積。過量的ROS通過改變線粒體膜電位，激活天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，促進細胞凋亡[56]。此外，ROS可抑制三羧酸循環，使ATP生產減少，影響糖酵解代謝[57]。線粒體自噬可通過選擇性自噬降解受損及多余的線粒體，減少ROS積累，維持細胞穩態，若線粒體自噬受阻，會使ROS不斷累積，使糖酵解代謝產生過量乳酸，影響機體代謝[58]。PTEN激酶1(PTEN-induced kinase 1，PINK1)/E3泛素連接酶Parkin信號通路是介導線粒體吞噬最典型的途徑。

線粒體蛋白抑制素PHB/PHB2可與LC3相互作用，誘導細胞線粒體自噬，閆雨廷等[63]創新性的發現了蘿卜硫素可下調人非小細胞肺癌SK-1細胞的PHB水平，抑制自噬體與溶酶體結合，進而抑制線粒體自噬。該團隊還發現蘿卜硫素可通過破壞微管平衡，以抑制線粒體自噬。

除PINK1/parkin 介導的泛素依賴性線粒體自噬，還有直接與LC3結合的非泛素依賴性線粒體自噬。現階段發現的有非泛素依賴性自噬受體主要有BNIP3、FUNDC1、NIX、BCL2L13等。中醫藥通過PINK1/parkin通路影響線粒體自噬的相關研究較多，而對上述非泛素依賴性自噬受體及線粒體自噬適配體NDP52、OPTN的研究則尚無報道。

4 中醫藥對內質網自噬的研究

肺癌細胞的內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)可誘導自噬從而清除受損及多余細胞，從而調節免疫功能[64]，而持續過激的ERS則可促進癌細胞凋亡。Perk/IRE1/c-ATF6是干預ERS的主要信號通路，p-Perk 可下調ERS的水平，抑制細胞凋亡[65]。

汪超等[66]研究發現，橙皮素可誘導內質網應激相關蛋白 CHOP、 Caspase4、 Bip、 pJNK 及感受器蛋白 p-Perk、 IRE1 和 c-ATF6 表達水平上調。另有研究表明，丹參二萜醌可顯著上調IRE1α、Bip、TRAF2表達，從而促進腫瘤細胞的ERS，促進癌細胞的凋亡[67]。X盒結合蛋白(X-box binding protein 1，XBP1)具有影響脂質代謝，抑制免疫細胞的作用，在肺癌患者中，XBP1蛋白的表達明顯增多[68]。楊冰等[69]發現，黃芪黃酮可顯著下調肺癌細胞中XBP1及IRE1的表達，表明黃芪黃酮抗癌功效可能與其調控XBP1介導的 ERS相關。

5 結語與展望

中醫藥是祖國傳統文化的結晶，可通過多靶點、多途徑干預肺癌細胞的自噬，抑制肺癌細胞的增殖，對于臨床肺癌患者的治療具有重要意義。雖然現階段中藥對肺癌細胞自噬的影響的研究越來越多，但仍然存在著一些問題：(1)肺癌的病因尚未完全闡明，多種基因、多種信號通路都可產生影響，給研究帶來困難；(2)目前自噬與肺癌細胞的相關研究，主要為體外細胞培養實驗，這是因為自噬體在體內研究需要持續監測，后續的研究方案應突破這種局限性，注重在肺癌體內模型中分析自噬的作用，得到更為可靠的結論；(3)中醫藥多集中于對PI3K/Akt/mTOR、p53/AMPK/mTOR、MAPK等熱點通路的研究，對其他信號通路的尚需深入、系統地研究；(4)中醫藥對于線粒體及內質網自噬的研究較少，且多以中草藥單體成分為主；(5)中醫藥具有多靶點作用的特性，中藥成分較復雜，難以控制單一變量，而且中醫辨證理論難以與細胞自噬機制相結合，這都給研究帶來挑戰；(6)非編碼RNA對自噬及肺癌細胞的影響已被證實[70]，中藥可通過調控LncRNA、miRNA以影響細胞自噬。后續會以“LncRNA/miRNAs—自噬相關信號通路—自噬相關蛋白”為研究點，未來進行更為深入、系統的生物分子學實驗研究，注重細胞自噬的體內模型研究設計，以開拓中醫藥治療肺癌的應用前景。