AM真菌共生系統中硝態氮吸收轉運途徑及對寄主生長的作用*

李夢瑤，蔣湘艷，金海如

（浙江師范大學化學與生命科學學院，浙江金華 321004）

同位素示蹤技術及酶學和基因表達分析至今已證實AM真菌吸收氮素并轉運給植物，其能利用無機態的銨態氮、硝態氮，有機態的氨基酸等[1-5]，而且Jin等[5-7]利用AM真菌（Glomus intraradices）與毛根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根（Ri T-DNA transformed carrotroots）建立的雙重培養系統研究提出了AMF菌絲內氮素運轉模型，即AM真菌也可以從土壤吸收多種不同來源的氮，如NH4+、NO3-和氨基酸，這些不同的氮源通過AM真菌根外菌絲內谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途徑被吸收利用，而吸收的氮大都整合入精氨酸（Arg）分子，合成的精氨酸可以被AM真菌根外菌絲完整地運轉至根內菌絲，而且可以在菌絲體內雙向運轉，再將被輸送的精氨酸通過尿素循環（urea cycle）釋放出N，以形式傳遞給植物寄主。這為進一步研究AM真菌對氮素的吸收和傳遞特點提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 離體培養菌根

采用分隔培養皿方法將毛根農桿菌質粒DNA轉化的胡蘿卜根（Ri T-DNA trans-formed carrot roots）（Daucus carotaL.）于24℃培養在含有4 g·L-1植物膠的改進型M培養基中[5]。菌根室的培養基依照Jin等[5]方法改進后限制氮濃度。

1.2 對不同碳、氮源的吸收和13C/15N的標記

氮素吸收和15N標記實驗在經改良不含葡萄糖的 液 體M培 養 基 中 進 行[18]。用180 mg·L-1CaCl2·2H2O代替288 mg·L-1Ca（NO3）2·4H2O，標記的15N底物為氮素唯一來源。13C/15N標記的底物（98%）為：[15N，98%]KNO3+13C1，2乙酸鹽或13C6-葡 萄 糖、[15N]KNO3（4 mmol·L-1）、15NH4NO3（4 mmol·L-1）、NH415NO3（4 mmol·L-1）和[15N，98%]15NH4SO4。標記物溶液過濾消毒后加至60 mm滅菌培養皿中培養，不加其他氮源。配好培養基后調節pH至6.0。每種氮源重復處理6個培養皿，作為3個重復。

1.3 游離氨基酸提取

培養1天、3天、1周、3周和6周后，用38 μm網狀篩收集菌根和菌絲及孢子，去離子水清洗。樣品冷凍干燥后加入少許酸洗過的沙用研缽研磨，用4℃ NH4HCO3緩沖液（pH = 8，含0.2% NaN3）提取。提取液在40 mL NH4HCO3緩沖液中于4℃透析24 h，透析膜允許分子量2 000的分子透過。收集滲透液，冷凍干燥后-20℃儲存。然后溶解于2 mL 0.01 mol·L-1HCl，裝入陽離子交換柱（0.3 mL的DOWEX 50 X 8-200-陽離子型），柱先用2 mol·L-1NH4OH、2 mol·L-1HCl和去離子水潤洗，再用去離子水洗至流出液為中性。用5 mL去離子水洗下柱的中性復合物，再用2 mL 1 mol·L-1的NH4OH洗脫收集游離氨基酸。洗提液收集后冷凍干燥用于GC-MS和HPLC分析。孢子中游離氨基酸提取和分析時用外標法計算各種氨基酸的濃度，每個樣品重復3次。

1.4 AM真菌菌根中可溶性蛋白質的酶水解

1.3中透析膜內物質離心后，上層含有可溶性蛋白質，冷凍干燥后重新懸浮在600 μL 20 mmol·L-1的NH4HCO3緩沖液中（pH = 8，含0.2% NaN3）。加入新鮮溶解蛋白酶（2 μL氨肽酶M，2 μL鏈霉蛋白酶E，2 μL羧肽酶Y），30℃振蕩培養6 h。加入新鮮的酶繼續培養6 h，4℃ 10 000 r·min-1轉下離心10 min，上層清液冷凍干燥并重新懸浮于2 mL水中，隨后冷凍干燥懸浮于1 mL水中。所得可溶性蛋白氨基酸按照1.3步驟純化，用MS進行15N的測定。

1.5 自由氨基酸的同位素分析

用GC-MS分析標記氨基酸[5]。從組織中提取的氨基酸進行衍生化反應。先加入10～20 μL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），根據樣品量加30～50 μL的N-甲基-N-特丁基二甲基硅烷-三氟乙酰胺（MTBSTFA），110℃電爐上加熱30 min。

甲硅烷基化的提取物注射入Finnigan Trace MS 2000設備，0.25 μm厚的石英毛細管柱（直徑0.25 mm，長30 m，RTX-5MS，Restek Inc.Flemington，NJ），此柱連接到質譜儀的四極質量檢測器（Thermo Electron，Madison WI）上，He作為載氣，流速1 mL·min-1。程序升溫：110℃ 2 min，10℃·min-1升溫至260℃，維持5 min。電子沖擊離子化能量70 eV，檢測器掃描質量范圍150～600 m·z-1，時間0.5 s，與20種標準氨基酸比較，鑒定樣品中的氨基酸。除Arg外，Orn和其他氨基酸通過N-（特丁基二甲基硅）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）衍生化后測定M-57離子確定。

1.6 HPLC分析氨基酸的含量

根據Endres和Mercier[19]的方法用WatersTM（Milford，MA）717HPLC系統測定各種氨基酸含量。設備包括Waters510自動取樣器和泵，一個Waters可調吸收檢測器和Millenium數據處理軟件。提取的氨基酸溶解于500 μL 0.1 mol·L-1HCl，Pico-Tag工作臺上真空干燥，加入乙醇、水和三乙胺（體積比2︰2︰1）后真空干燥。隨后加入乙醇、水、三乙胺和異硫氰酸苯酯（體積比7︰1︰1︰1）室溫放置20 min，進行氨基酸衍生反應，衍生物真空干燥后備用。每個樣品取20 μL注射至反相C18柱（3.9 mm內徑× 150 mm長）。38 mL的Pico-Tag洗脫液A和B作為流動相；洗脫液流速為1 mL·min-1，其中洗脫液B比例逐漸上升。檢測波長254 nm。測定前所有溶液真空條件除氣1 min。與已知標準氨基酸的峰值和保留時間比較，計算樣品中各種氨基酸的含量。

1.7 AM真菌不同無機態氮吸收利用對寄主植物甜玉米生長的實驗

在特制培養盒中加入適量滅菌的沙土。選取飽滿的新鮮甜玉米種子，消毒后播種。接種 AM 真菌根內球囊霉（G. intraradices），每隔一周，施加改良的霍格蘭德營養液 50 mL補充營養，培養一段時間后移栽入大田中。繼續施加改良的霍格蘭德營養液，共施加5次，同時補充不同氮素（尿素、尿素+有機肥、硝酸鉀、硝酸鈣和硫酸銨）。氮濃度為 4 mmol·L-1的無機氮源。此外，分別施加濃度為0.15 g·L-1（高磷）和 0.05 g·L-1（低磷）的磷酸二氫鉀溶液，每次100 mL。實驗玉米共生長60 d后回收分析其株重。甜玉米試驗每種氮源重復處理15株。

1.8 統計分析

對重復樣品分析得到的結果采用SPSS 18.0軟件進行相關統計分析。

2 結 果

2.1 AM真菌對不同無機態氮素的吸收特征

圖1 AM真菌共生系統中菌絲室用15NH4NO3或NH415NO3處理6天時其根外菌絲（a）和菌根組織（b）自由氨基酸的15N標記Fig. 1 15N labelling of free amino acids in extraradical mycelium（ERM）（a）and mycerrhizal tissues（b）in the hypha compartment of the AM fungi symbiosis treated with 15NH4NO3，NH415NO3 or 15NH4 for 6 days

2.2 AM真菌共生系統中外源碳和氮源對菌絲合成精氨酸的影響

AM真菌根外菌絲加13C6-葡萄糖培養6周后，菌根組織的精氨酸和蛋白質中均未發現13C（表1），說明其根外菌絲不能利用葡萄糖。而無侵染的根組織培養于13C6-葡萄糖6周后，根組織中的自由精氨酸13C豐度為22.8%±1.8%，根蛋白質中13C豐度為17.7%±1.0%，表明根組織可以吸收利用葡萄糖合成精氨酸，其自由精氨酸濃度為10.9%±4.8%，菌根蛋白質中精氨酸濃度為10.2%±0.5%。菌絲室加13C1，2-乙酸鈉后，菌根組織的精氨酸和蛋白質中都發現有13C標記，分別為8.5%±2.3%和7.6%±0.7%，說明其根外菌絲能吸收利用乙酸鹽中的碳素，此時其自由精氨酸濃度為10.3%±0.3%，菌根蛋白質中精氨酸濃度為8.3%±0.8%。

表1 外源碳和氮源對菌根組織及其蛋白質中精氨酸濃度和同位素豐度的影響Table 1 Effect of exogenous carbon and nitrogen input on formation and 13C/15N labelling of Arg in mrcorrhizal tissues and protein

菌絲室加13C1，2乙酸鈉+15NO3后，隨著氮源的增加，其自由精氨酸濃度提高為54.2%±19.3%，菌根蛋白質中精氨酸濃度變化不大，為8.0%±0.7%；同時菌根組織的精氨酸和蛋白質中C/N同位素標記豐度大大提高，分別為57.4%±4.8%和50.3%±2.8%。說明菌絲室增加可利用碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成。

2.3 AM真菌吸收利用不同無機態氮對寄主植物甜玉米生長的影響

大田試驗中（如圖2），在低磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀菌根化玉米莖葉重明顯提高，相對無菌根化低磷條件下的甜玉米提高了12.28%，其次硝酸鈣也有提高作用，可提高2.94%；硫酸銨則不如硝酸鉀對AM真菌菌根化甜玉米株重的促進作用，反而是降低了其生物量8.19%，尿素則降低了13.02%，但尿素和有機肥則緩解這種生物量抑制作用。

圖2 不同氮素形態在高磷和低磷下對甜玉米株重的影響Fig. 2 Effect of form of applied nitrogen on per-plant weight of sweet corn cultured in soil high/low in P concentration

在高磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀菌根化玉米穗重顯著提高，相對無菌高磷提高達31.75%，其次硝酸鈣提高2.43%；硫酸銨則不如硝酸鉀，只有1.32%，尿素在高磷下則減少其生物量11.97%，施加尿素和有機肥則緩解抑制作用，反而提高3.52%。

3 討 論

3.1 AM真菌吸收和轉運無機態氮素的模式差異

3.2 外源碳和氮素對AM真菌合成精氨酸的影響

精氨酸是AM真菌菌絲轉運氮素的載體。在菌絲和菌根組織中的精氨酸濃度反映了其合成、轉運及分解的平衡結果。Jin等[5]用HPLC分析了AM菌絲吸收利用合成精氨酸的濃度，是菌絲中自由氨基酸的主要成分。本研究發現AM真菌根外菌絲加13C6-葡萄糖，培養6周后，菌根組織的精氨酸和蛋白質均未發現13C，說明其根外菌絲不能利用葡萄糖。菌絲室加13C1，2乙酸鈉后，菌根組織的精氨酸和蛋白質中均發現13C，說明其根外菌絲能吸收利用乙酸鹽中的碳素；菌絲室加13C1，2乙酸鈉+15NO3后，隨著氮源的增加，其自由精氨酸濃度提高為54.2%±19.3%，菌根蛋白質中精氨酸濃度變化不大；同時菌根組織的精氨酸和蛋白質中C/N同位素標記豐度大大提高。說明菌絲室增加可利用碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成，但是不清楚精氨酸合成是在根內菌絲還是寄主根內合成為主。在AM真菌共生系統施加有機質，可以部分分解為氨基酸和有機酸（乙酸等）等再被菌絲吸收利用，減少從寄主吸收碳水化合物，從而緩解AM真菌對寄主生物量的抑制作用。

3.3 AM真菌吸收不同氮素對寄主植物生長的影響

大田試驗中，本研究發現在低磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀后，菌根化玉米莖葉重明顯提高。硫酸銨則不如硝酸鉀對AM真菌菌根化甜玉米株重的促進作用，尿素則降低了13.02%，但是尿素再加有機肥則可以緩解這種生物量抑制作用。Thirkell等[27]也報道了AM真菌菌絲接觸有機質后可以提高寄主植物氮和磷水平，同時也提高了寄主生物量。

在高磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀后，菌根化玉米穗重明顯提高；硫酸銨則不如硝酸鉀，尿素在高磷下則減少其生物量11.97%，施加有機肥則緩解抑制作用，反而提高3.52%。相比較，國內鄧胤等[14]研究了不同氮磷水平對玉米生長的影響，以NH4NO3為氮源，在高濃度外界氮和磷下，接種AM真菌對玉米營養無貢獻，只有在正常氮濃度2 mol·L-1時，顯著提高生物量。顯然，該作者沒有區別AM真菌對不同無機態氮素的吸收差別。冉瓊和鐘章成[28]則發現AM真菌能夠通過促進玉米幼苗N、P吸收及葉綠素含量增加，光化學效率、氣孔導度增大，從而提高玉米幼苗光合作用能力促進生長。

4 結 論

AM真菌對銨和硝態氮的吸收和轉運有兩種不同模式，對于銨態氮（和尿素），AM真菌通過根外菌絲內谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途徑被吸收利用的，而吸收的氮大都整合入精氨酸（Arg）分子，合成的精氨酸可以被AM真菌根外菌絲完整地運轉至根內菌絲，而且可以在菌絲體內雙向運轉，再將被輸送的精氨酸通過尿素循環（urea cycle）釋放出N，以形式傳遞給植物寄主。對于硝態氮則除了小部分被ERM吸收還原為進入尿素循環，大部分則是通過根外菌絲轉運（可以排除菌絲擴散作用，經檢測培養基中濃度很低，數據未發表）至IRM的叢枝結構（檢測菌根組織中積累了數據未發表），進而推測在硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）和亞硝酸鹽還原酶作用下形成銨，再傳遞給寄主植物利用（硝酸還原酶基因表達數據；宿主植物受到AM真菌誘導的銨吸收轉運蛋白基因的表達數據在后續文章中發表）。這個新模式是首次報道了硝態氮轉運吸收途徑。