反相高效液相色譜法測定常見食品中乳酸、富馬酸的含量

陳振中

（中科檢測技術服務（廣州）股份有限公司，廣東廣州 510000）

摘 要：為測定常見食品中乳酸、富馬酸的含量，建立了常見食品中乳酸、富馬酸提取及反相高效液相色譜的測定方法。本實驗選用葡萄酒、含乳飲料、糕點為基質，添加乳酸、富馬酸標準品混勻，用水浸泡超聲提取、稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過0.45μm 無機濾膜后，以高效液相色譜反相C18柱分離，通過PDA二極管陣列檢測器檢測。檢測結果顯示，以上3種基質用該測定方法檢測的平均回收率分別為乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富馬酸96.3%、95.5%、97.9%;相對標準偏差分別為乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富馬酸1.2%、1.0%、0.3%。

關鍵詞：常見食品;乳酸;富馬酸;反向高效液相色譜法;PDA二極管陣列檢測器

Determination of Lactic Acid and Fumaric Acid in Several Common Foods by High-performance Liquid Chromatography

CHEN Zhenzhong

（CAS Testing Technical Services （Guangzhou） CO.， Ltd.， Guangzhou 510000， China）

Abstract： In order to determine the content of lactic acid and fumaric acid in common foods， methods for the determination of lactic acid and fumaric acid extraction and reversed-phase high performance liquid chromatography in common foods were established. In this experiment， wine， milk-containing beverages， and pastries were used as the substrate， and lactic acid and fumaric acid standards were added and mixed， soaked in water and ultrasonically extracted， diluted to the mark， shaken， centrifuged at 5 000 r/min for 10 minutes， and the supernatant was passed through a 0.45μm? inorganic filter membrane. It was then used as a sample solution， and then separated by a reversed-phase C18 column of high performance liquid chromatography， and detected by a PDA diode array detector. The test results show that the average recoveries of the above 3 substrates detected by this method are lactic acid 97.7%， 95.5%， 99.1%， fumaric acid 96.3%， 95.5%， 97.9%; the relative standard deviations are lactic acid 1.1%， 1.5%， 4.4%， fumaric acid 1.2%， 1.0%， 0.3%.

Keywords： common foods; lactic acid; fumaric acid; high-performance liquid chromatography; PDA diode array detector

富馬酸即名延胡索酸，富馬酸可作為酸度調節劑、酸化劑、抗氧化助劑、腌制促進劑和香料使用。本品有強緩沖作用，保持水溶液pH在3.0左右，并對抑菌防霉有重要作用，同時有澀味，是酸味極強的固體酸之一，吸收率低，有助于延長粉末制品等的保存期。當富馬酸變為富馬酸鈉后，水溶性及風味均更好。乳酸有很強的防腐保鮮功效，可用在果酒、飲料、糕點等食品中具有調節pH值、抑菌、延長保質期、調味、保持食品色澤和提高產品質量等作用，食品中加入一定量的乳酸，可保持產品中的微生物的穩定性、安全性，同時使口味更加溫和[1]。

現行有效的高效液相色譜法檢測食品中的富馬酸、乳酸的方法一般局限在飼料、果汁、農產品等，鮮有運用高效液相色譜法同時測定食品中的富馬酸、乳酸的方法。本實驗建立了常見食品中乳酸、富馬酸提取及反相高效液相色譜的測定方法，選用含乳飲料、葡萄酒、糕點為基質，添加乳酸、富馬酸標準品混勻，用水浸泡、稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm無機濾膜后作為樣液，然后以高效液相色譜反相C18柱分離，通過PDA二極管陣列檢測器檢測[9]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試含乳飲料（原味椰子果粒酸奶飲品，廣州市貝奇飲料有限公司生產）;供試葡萄酒（菲芃莊園葡萄酒，廣州市圣羅倫酒業有限公司生產）;供試糕點（核桃包，廣州包多寶食品有限公司生產）;乳酸標準品（含量89.9%，英國LGC公司）;富馬酸標準品（含量99.2%，英國LGC公司）;磷酸二氫銨（分析純，廣州化學試劑廠）;超純水（電阻率為

18.2 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

Alliance e2695高效液相色譜系統（美國Waters公司）;2998 PDA Detector光電二極管陣列檢測器（美國Waters公司）;Uranus C18色譜柱（4.6 mm×

250 mm×5 μm，廣州菲羅門科學儀器有限公司），電子分析天平（GH-252，廣州市艾安得儀器有限公司）;超聲波清洗機（GT-2013QTS，廣東固特超聲股份有限公司）;低速離心機（KA-1000，上海安亭科學儀器廠）;Cascada I 超純水儀（美國PALL公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸、富馬酸標準溶液配制

秤取乳酸標準品55.6 mg、富馬酸標準品50.4 mg，分別加水轉移至50.0 mL容量瓶中，定容至刻度，配置成濃度均為1.0 mg/mL的乳酸、富馬酸標準儲備溶液。分別吸取適量乳酸、富馬酸標準儲備溶液于50.0 mL容量瓶中，配制成6個不同濃度混標（包括空白試樣）。乳酸標準曲線濃度范圍：0 μg/mL、8.33 μg/mL、25.00 μg/mL、50.00 μg/mL、100.00 μg/mL、250.00 μg/mL;富馬酸標準曲線濃度范圍：0 μg/mL、0.083 3 μg/mL、0.250 0 μg/mL、5.000 0 μg/mL、10.000 0 μg/mL、25.000 0 μg/mL。

乳酸、富馬酸在上述濃度范圍內呈線性關系。線性回歸方程分別為：乳酸Y=16.733x-11.673、富馬酸Y=8.180x-5.590。相關系數分別為：乳酸R=0.999 97、富馬酸R=0.999 981.3.2 高效液相色譜條件色譜柱：Uranus C18色譜柱4.6 mm×250 mm×5 μm;流動相：1 mol/L磷酸二氫銨溶液，磷酸調節pH=2.5;流速：0.6 mL/min;檢測波長：210 nm;柱溫：40 ℃;進樣體積：10 μL。

1.3.3 樣品前處理

取有代表性樣品500 g混合均勻，裝入潔凈容器內密閉并標明標記，于4 ℃保存。秤取樣品約5 g（精確到0.000 1 g）于50 mL容量瓶中，25 mL超純水水浸泡1 h，超聲提取1 h，稀釋至刻度，搖勻，5 000 r/min離心10 min，上清液過0.45 μm無機濾膜后作為樣液，供HPLC測定。

1.3.4 流動相pH值相關性實驗

配制1 mol/L磷酸二氫銨溶液并用磷酸調節pH值，分別配制成pH=2.0、pH=2.5、pH=3.0的1 mol/L磷酸二氫銨溶液，分別以此作為流動相上機檢測，其他色譜條件不變。收集乳酸、富馬酸標樣保留時間、峰寬、分離度，分析兩者與流動相pH值的相關性，選擇最優流動相pH值進行后續實驗。

1.3.5 方法檢出限實驗

選用信噪比法確定方法檢出限。分別稱取500.0 g?3種基質樣品各3份，并分別添加乳酸、富馬酸標準物質10.0 mg、0.10 mg;50.0 mg、0.50 mg;100.0 mg、1.00 mg，每種基質樣品中乳酸、富馬酸樣品濃度水平分別為20.0 mg/kg、0.20 mg/kg;100.0 mg/kg、1.00 mg/kg;200.0 mg/kg、2.00 mg/kg。稱取適量樣品前處理后上機檢測，確定本實驗室對本方法的檢出限。

1.3.6 方法回收率與重復性實驗

稱取葡萄酒、含乳飲料、糕點3種基質樣品500.0 g各兩份，樣品中分別添加乳酸、富馬酸標準物質125.0 mg，1.25 mg樣品濃度水平為乳酸250.0 mg/kg、富馬酸2.50 mg/kg。按照本文樣品前處理方法提取及凈化處理樣品得到1.0 mL樣液 ，用高效液相色譜分析。

2 結果與分析

2.1 流動相pH值相關性

實驗數據如表1所示。由表1可知，當流動相pH=2.5、pH=3.0時，分離度（R）分別為3.183、7.821，均>2，有較好分離度。當流動相pH=2.5時，所有待測物完全出峰所需時間適中，且分離度（R）>2，所以后續實驗流動相pH均選擇pH=2.5。標準樣中目標物的色譜圖見圖1;葡萄酒、含乳飲料、糕點3種基質中目標物色譜圖分別見圖2～4。

2.2 方法檢出限

本文主要選用信噪比法進行研究。峰高及基線最大波動值數據如表2。由表2可知，乳酸濃度水平為100.0 mg/kg、富馬酸度水平為0.020 mg/kg時，信噪比明顯，分別為5倍、2倍，所以本實驗以乳酸濃度水平100.0 mg/kg、富馬酸度水平0.020 mg/kg為方法檢出限，與行業標準《進出口果汁中乳酸、檸檬酸、富馬酸含量檢測方法 高效液相色譜法》（SN/T 2007—2007）方法檢出限相近，符合要求。

2.3 方法回收率與重復性實驗

用高效液相色譜分析，每種基質樣品重復測定6次，進行加標回收和精密度實驗，結果計算X=。實驗數據如表3所示。本次實驗樣品基質空白為0，樣品濃度水平為乳酸250.0 mg/kg、富馬酸2.50 mg/kg，葡萄酒、含乳飲料、糕點3種樣品基質平均添加回收率分別為乳酸97.7%、95.5%、99.1%，富馬酸96.3%、95.5%、97.9%;相對標準偏差分別為乳酸1.1%、1.5%、4.4%，富馬酸1.2%、1.0%、0.3%，結果表明該方法精密度、重現性良好。

3 結論

本方法具有較低的檢出限，較好的靈敏度與重現性，能夠簡單、快速、靈敏地對常見食品基質中的乳酸、富馬酸實現較好地分離、定性與定量，適用于常見食品基質中乳酸、富馬酸含量的測定，適用于常見食品基質中乳酸、富馬酸含量檢測。

參考文獻

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