Csu-miR260轉基因水稻插入序列的表達檢測

羅彪 周池 陳彥超 周霆 柳初微 周鎮中 陳浩 饒力群 汪啟明

摘要 ：本文以具有抗二化螟性狀的Csu-miR260轉基因水稻為試驗材料，采用TaqMan探針實時熒光定量PCR（TaqMan RT-qPCR）和莖環實時熒光定量PCR（stem-loop RT-qPCR）分別對Csu-miR260轉基因抗蟲水稻中Csu-miR260插入序列和剪切形成的amiR260s的表達情況進行了定量檢測。發現Csu-miR260插入序列和剪切形成的20 nt和21 nt兩種長度amiR260s在轉基因抗蟲水稻苗期的根、莖、葉中表達，且無組織表達特異性。該試驗解決了人工miRNA作物中amiRNA及前體檢測引物的特異性問題，為人工miRNA植物干擾序列的表達分析提供技術參考，并為miRNA轉基因作物遺傳表達相關安全評價提供了數據參考。

關鍵詞 ：人工miRNA; 抗蟲水稻; TaqMan實時定量PCR; 莖環實時定量PCR; 轉基因安全評價

中圖分類號：

S 511

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020429

Detection of expression of inserted sequence in Csu-miR260 transgenic rice

LUO Biao1， ZHOU Chi1， CHEN Yanchao1， ZHOU Ting1， LIU Chuwei1，

ZHOU Zhenzhong1， CHEN Hao2， RAO Liqun1， WANG Qiming1*

（1. College of Bioscience and Biotechnology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China;

2. National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract

In this article， the expression of insert sequence Csu-miR260 from transgenic rice with resistance to Chilo suppressalis and two length（20 nt and 21 nt） of amiRNA formed by shearing Csu-miR260 were quantitatively determined by using TaqMan probe real-time fluorescent quantitative PCR （TaqMan RT-qPCR） and stem-loop real-time fluorescent quantitative PCR （stem-loop RT-qPCR）. It was found that the expression of the insert sequence Csu-miR260 and amiRNA formed by shearing Csu-miR260 were no tissue specificity in the roots， stems and leaves of the transgenic insect-resistant rice seedlings. This test solves the problem of specificity of amiRNA and precursor detection primers in artificial miRNA crops， provides technical reference for the expression analysis of artificial miRNA plant interference sequences. It also provides a data reference for the safety evaluation of genetic expression in miRNA transgenic crops.

Key words

artificial miRNA; insect-resistant rice; TaqMan RT-qPCR; stem-loop RT-qPCR; safety evaluation of transgenic plants

自1996年以來，轉基因作物在全球大面積推廣[1]，有效緩解了農作物面臨的病蟲害和營養不足等問題，并帶來了巨大的收益[2]，但轉基因作物的安全問題一直是被關注的熱點[3]。隨著轉基因技術不斷發展，進入市場的轉基因產品除了轉入表達蛋白的轉基因作物[45]，也出現了以表達的核酸作為殺蟲物質的轉基因作物，但是我國目前尚無專門針對此類轉基因作物的安全評價技術體系[68]。近年來昆蟲特異性miRNA開始用于害蟲的防治，具有很好的應用前景[911]。用人工microRNAs（amiRNAs）技術防治害蟲是一種很有效的策略[12]，其對環境和非昆蟲物種的負面影響較小。amiRNAs技術通過將水稻miR528前體中miR528/miR528*序列替換成昆蟲miRNA/miRNA*序列，再使用組成型啟動子實現昆蟲miRNA在水稻中的高水平表達[1314]。二化螟Chilo suppressalis是水稻害蟲之一，給水稻產量帶來巨大的損失[15]。Csu-miR260參與調節二化螟的變態發育過程，其作用的靶基因為蛻皮素生物合成途徑中的Dib基因，通過抑制20-羥基蛻皮激素的合成誘導二化螟死亡或導致其發育遲緩[16]。通過amiRNAs技術將Csu-miR260引入水稻miR528前體中，能夠獲得有抗蟲效果的Csu-miR260轉基因水稻。

外源miRNA的表達特征和剪切后的序列特征對于轉miRNA基因作物的安全性評估非常重要[58]。然而對轉基因植物中amiRNA前體的精確加工和是否生成預期的amiRNA還了解得不充分[13，1719]，amiRNA的形成和沉默效率通常取決于amiRNA的設計[2022]，由于轉amiRNA基因的植物可能不生成amiRNAs或生成預測之外的amiRNAs，制約了miRNA轉基因植物中miRNA及其前體的檢測。目前有多種檢測轉基因植物中miRNA及其前體的方法，如Northern blot[23]、微陣列、定量RT-PCR和高通量測序等。Northern blot復雜耗時，檢測miRNAs靈敏度低;定量RT-PCR由于動態范圍最廣、準確度最高，常被用作RNA定量的金標準[24]。莖環法，加尾法等定量RT-PCR技術常用來檢測成熟miRNA的表達[2526]，但由于Csu-miR260轉基因水稻轉入的Csu-miR260和水稻miR528前體序列高度同源，SYBR Green 染料法無法準確區分，其次人工Csu-miR260替換片段長度為27 bp，超過21 bp，限制了amiRNA特異性引物的設計。因此本研究采用基于qRT-PCR的TaqMan探針法和莖環法分別對Csu-miR260轉基因水稻中Csu-miR260插入序列以及成熟miR260進行定量檢測，以期為Csu-miR260轉基因作物的安全性評估奠定基礎，并為其他miRNA轉基因植物的特異性檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：華中農業大學提供的兩個轉基因抗蟲水稻株系‘Csu-miR260-16’‘Csu-miR260-18’和野生型‘中花11’，培養室生長至3～4葉期?！瓹su-miR260-16’的插入位點位于1號染色體11863348-11863480處，插入片段長5 086 bp，‘Csu-miR260-18’的插入位點位于4號染色體31311317-31311395處，插入片段長4 973 bp。轉基因水稻轉化元件構建如圖1所示。osa-miR260全長251 bp，其中水稻miR528前體中21 nt miR528/miR528*替換成27 nt的二化螟miR260/miR260*，下文稱其為Csu-miR260插入序列。

試劑：TRIzol試劑，上海ThermoFisher公司;反轉錄試劑盒GoldenstarTM RT6 cDNA Synthesis Mix，2×T5 Fast qPCR Mix （Probe），長沙擎科生物公司;miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒（莖環法），上海生工生物工程公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取

采用TRIzol法分別提取苗期‘Csu-miR260-16’‘Csu-miR260-18’和‘中花11’的根、莖、葉RNA。使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測量RNA濃度。

1.2.2 TaqMan RT-qPCR檢測Csu-miR260插入序列

1.2.2.1 探針設計

由于Csu-miR260插入序列與Osa-miR528前體高度同源，設計特異性探針和引物（圖2）。引物和探針由擎科生物公司合成（表1）。

1.2.2.2 質粒標準品合成

制備Csu-miR260插入序列的質粒標準品，其中Csu-miR260插入序列251 bp （圖2b），載體序列1 818 bp，總共2 069 bp，質粒標準品由擎科生物公司合成。

1.2.2.3 標準曲線制作

將質粒標準品以10倍梯度法稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-55個梯度，分別以稀釋液為模板進行TaqMan RT-qPCR。測量質粒標準品OD 260，按照OD 260=1時dsDNA濃度為50 ng/μL計算質粒標準品濃度，再根據拷貝數=6.023×（a/b）×1014計算不同濃度的質粒標準品的拷貝數，其中a為質粒標準品質量（ng），b為質粒分子量（g/mol）。PCR擴增效率計算公式En=[10（-1/c）-1]×100%，c為標準曲線斜率。

1.2.2.4 cDNA合成

以RNA為模板合成cDNA。反轉錄體系：總RNA 1 μg， gDNA remover 1 μL， 10×gDNA remover buffer 1 μL，補充RNase free H 2O至10 μL。充分混勻，短暫離心后將離心管置于PCR儀中42℃孵育2 min，60℃孵育5 min，去除基因組DNA。再轉移至冰上迅速冷卻，加入4 μL Goldenstar_RT6_cDNA_Synthesis_Mix，補足RNase free H 2O至20 μL。充分混勻，短暫離心后，將離心管置于PCR儀中50℃反轉錄反應15 min，85℃ 5 min使反轉錄酶失活，得到cDNA。

1.2.2.5 TaqMan 實時熒光定量RT-PCR

以cDNA為模板進行TaqMan RT-qPCR。反應體系：2×T5 Fast qPCR Mix（probe）10 μL，10 μmol/L miR260-F、miR260-R各0.7 μL，10 μmol/L探針0.6 μL，cDNA 2 μL，ddH 2O 補足至20 μL。TaqMan熒光定量反應程序：第1步95℃預變性2 min;第2步95℃變性10 s;第3步60℃延伸30 s。第3步收集熒光信號，第2步至第3步40個循環。試驗進行3次生物學重復。采用絕對定量方法檢測Csu-miR260插入序列的拷貝數，制作Csu-miR260插入序列質粒標準品的標準曲線，再將各待測樣品RNA按1 μg反轉錄，最后將各待測樣定量PCR的C t值代入標準曲線計算拷貝數。

1.2.3 莖環RT-qPCR檢測成熟amiR260s

通過小RNA測序發現‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’中amiR260s長度集中分布在20 nt和21 nt（表2）。為了驗證和明確這兩條amiR260s序列在各組織表達情況，采用莖環RT-qPCR對其在組織中的表達進行定量檢測。

1.2.3.1 莖環引物設計

根據20 nt和21 nt amiR260序列特征設計莖環引物（表3）。

1.2.3.2 cDNA合成

以RNA為模板合成cDNA。反轉錄體系：總RNA 3 μg， miRNA L-RT Enzyme mix 1.5 μL，2×miRNA L-RT Solution mix 10 μL，10 μmol/L Stem-loop primer 1 μL， RNase free H 2O補足至20 μL。輕輕混勻后離心3～5 s，反應混合物16℃溫浴30 min，然后37℃溫浴30 min，85℃加熱5 min使酶失活，4℃保存。

1.2.3.3 SYBR實時熒光定量PCR

反應體系：2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL，cDNA 1 μL，正向引物260F20或260F21和通用反向引物260R 各0.8 μL，補充 RNase free H 2O至 20 μL。PCR反應程序（三步法）：95℃ 1 min; 95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 30 s，40個循環。熔解曲線分析：95℃15 s，60℃ 1 min，95℃15 s，60℃ 15 s。試驗進行3次生物學重復。相對定量使用2-ΔΔCt法計算，ΔΔC t =（C t目標基因-C t內參基因） 試驗組-（C t目標基因-C t內參基因） 對照組。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果

使用NanoDrop 2000超微量分光光度計測量苗期根、莖、葉RNA的純度，結果顯示其OD 260/OD 280在1.8～2.1之間。電泳結果顯示28S和18S條帶清晰（圖3），表明RNA整體質量較好，能滿足后續試驗要求。

2.2 TaqMan RT-qPCR檢測Csu-miR260插入序列

2.2.1 質粒標準品拷貝數

質粒標準品堿基數為2 069 bp，分子量為1 365 540，OD 260平均值為2.563，質粒標準品濃度為128.2 ng/μL。1 ng質粒標準品的拷貝數為439 386 616個。

2.2.2 標準曲線

以不同濃度的質粒標準品為模板進行TaqMan RT-qPCR，制作標準曲線（圖4）。結果表明，標準曲線R2大于0.99，并且斜率為-3.344，在-3.1～-3.5的范圍內，PCR擴增效率En=99.1%，在90%～110%之間，符合標準曲線條件。

2.2.3 TaqMan RT-qPCR檢測結果

TaqMan熒光定量檢測結果發現，擴增曲線起峰集中分布在C t值22和C t值33兩處，‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’的各組織樣品皆在C t值22左右起峰，野生型各組織樣品和陰性對照C t值皆在33左右。該結果說明TaqMan探針能明顯區分Csu-miR260插入序列和內源miR528前體序列，表明了探針法對Csu-miR260插入序列的檢測具有高特異性。

通過標準曲線計算Csu-miR260轉基因水稻各組織中Csu-miR260插入序列表達的拷貝數（圖5），發現Csu-miR260插入序列在‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’各組織中表達的拷貝數基本一致。說明在泛素啟動子的作用下，Csu-miR260轉基因水稻實現了Csu-miR260插入序列在各組織中高效且等量表達。Csu-miR260插入序列的正常轉錄和穩定表達，為其產生成熟的miR260和達到相應抗蟲劑量提供了核酸基礎。

2.3 莖環RT-qPCR檢測成熟amiR260s

Csu-miR260插入序列在水稻Dicer-like1（DCL1）酶[27]加工下形成20 nt和21 nt兩種長度的amiR260s，通過莖環RT-qPCR對這兩種長度的amiR260s進行表達驗證以及組織特異性表達分析（圖6），發現20 nt和21 nt兩種長度的amiR260s均在‘Csu-miR260-16’和‘Csu-miR260-18’中表達，且無組織表達特異性，這與Csu-miR260插入序列在各組織表達特征相同。說明在泛素啟動子的作用下，Csu-miR260轉基因水稻分別實現了Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s的無組織特異性表達。Csu-miR260插入序列的成功剪切和amiR260s的各組織穩定表達為其抗蟲功能分析奠定了分子基礎。

3 討論

擬南芥和水稻中Dicer-like1酶一般剪切前體miRNA生成21 nt成熟的miRNA[14，17，28]，amiRNA技術中替換片段也普遍在21 bp左右[14，24，29]。對于人工miRNA轉基因植物的鑒定和表達檢測通常也是針對預測的21 bp amiRNA來設計引物或探針，但對于更長的amiRNA替換片段的檢測，由于預測序列未知，制約了人工miRNA植物的鑒定和檢測。本文通過小RNA測序發現轉入的Csu-miR260的27 nt序列在水稻體內被加工成20 nt和21 nt兩個RNA片段，通過莖環法對兩個片段進行驗證，發現該結果與植物Dicer-like1酶的剪切功能相符，說明不同長度amiRNA替換片段在植物內形成了21 nt左右amiRNAs。通過分析兩個片段的序列，發現amiRNA的檢測引物應該根據替換片段5′端起的21 nt的序列來設計，該結果為人工miRNA轉基因植物amiRNAs的特異檢測提供技術參考，同時也為amiRNAs技術在植物中的設計提供參考。本試驗建立的基于實時定量PCR的TaqMan探針法檢測miRNA前體以及莖環法檢測miRNAs的方法具有操作簡單、特異性強等優點，可作為人工miRNA和發夾RNAi等類型的轉基因植物中功能序列表達檢測方法，以促進對各類miRNA的功能研究。

本文對Csu-miR260轉基因水稻的Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s進行了定量分析，明確了其表達模式，即在組成型泛素啟動子作用下，Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s在各組織中穩定表達且無組織特異性，為Csu-miR260轉基因水稻遺傳表達提供了詳細準確的安全評價數據。其次，本研究發現Csu-miR260轉基因水稻產生了非預期的人工miRNA片段，即27 nt Csu-miR260在水稻中形成了20 nt和21 nt兩個新的RNA片段。因此miRNA轉基因水稻安全性評估中應側重于對新引入的兩個RNA片段的安全性評估[78]，即新的amiRNA是否導致水稻內源基因的非預期沉默，同時要評價新的amiRNA的抗蟲效果，20 nt和21 nt兩個新的人工miRNA片段的抗螟蟲效果是否與27 nt Csu-miR260的抗螟蟲效果一致。抗蟲效果的下降或消失等都會影響Csu-miR260轉基因水稻的商品化。因此對于該類型的轉基因作物可以進行額外的測試來評估任何預期或非預期的成分變化帶來的安全性問題和功能效率問題。本試驗明確了Csu-miR260插入序列和成熟amiR260s的序列特征以及組織表達特征，為Csu-miR260轉基因水稻的安全性評價提供了準確的插入序列表達數據，同時為該類型轉基因作物的安全評價提供數據參考，以促進miRNA轉基因作物安全性評價方法的進一步完善。

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（責任編輯：田 喆）