復(fù)方苦參注射液總糖純化方法及含量測(cè)定研究

王洪玲 段秀梅 海麗娜 秦文杰 王鵬飛 畢小鳳 張亞錳

【摘 要】 目的：建立復(fù)方苦參注射液總糖純化及含量測(cè)定方法。方法：以單因素考察對(duì)復(fù)方苦參注射液總糖純化條件進(jìn)行優(yōu)選，以苯酚-硫酸法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中總糖含量。結(jié)果：復(fù)方苦參注射液總糖純化條件：復(fù)方苦參注射液1mL，稀釋5倍，在床容積（BV）為15mL的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行上樣，用3BV水洗脫，洗脫流速為0.566mL/cm2·min，得濾出液;苯酚硫酸法測(cè)定復(fù)方苦參注射液總糖專屬性良好，濃度在28.06～92.18μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9997，樣品精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐用性RSD分別為0.02%、1.51%、0.72%、0.31%，加樣回收率為96.84%～104.46%。結(jié)論：采用大孔吸附樹(shù)脂純化復(fù)方苦參注射液中的總糖準(zhǔn)確可靠，用苯酚-硫酸方法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中的總糖快速準(zhǔn)確，可作為復(fù)方苦參注射液總糖純化、測(cè)定方法。

【關(guān)鍵詞】 復(fù)方苦參注射液;總糖;大孔吸附樹(shù)脂;苯酚-硫酸法

【中圖分類號(hào)】?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2021）21-0057-05

Research on Purification Method and Determination of Total Sugar in Compound Kushen Injection

WANG Hongling DUAN Xiumei HAI Lina QIN Wenjie* WANG Pengfei BI Xiaofeng ZHANG Yameng

Beijing Zhendong Pharmaceutical Research Institute Co.， Ltd， Beijing 100120，China

Abstract：Objective This study was to optimize the purification method of total sugar and establish a method for determining the total sugar in Compound Kushen Injection.Methods The conditions for purification of total sugar in Compound Kushen Injection were optimized by single factor investigation. The total sugar content in Compound Kushen Injection was determined by phenol-sulfuric acid method.Results The purification conditions of total sugar in compound Kushen injection： 1 mL of compound Kushen injectionwasdiluted 5 times and loaded on an AB-8 macroporous adsorption resin column with a bed volume （BV） of 15 mL， which was eluted with triple times BV of water. The elution flow rate is 0.566 mL/cm2·min， and the filtrate was obtained. The phenol-sulfuric acid method has a good specificity for determining the total sugar content in the compound? injection， and the linear relationship is good within the range of 28.06 to 92.18 μg/mL. The RSD of precision， repeatability， stability， and durability was 0.02%，1.51%，0.72%， and 0.31%， respectively， and the sample recovery rate was 96.84% to 104.46%.Conclusion The methods of macroporous adsorption resin purification and phenol-sulfuric acid determination in this study were accurate， reliable and rapid， which can be applied in the purification and determination of total sugar in compound Kushen injection.

Key words：Compound Kushen Injection; Total Sugar; Macroporous Adsorption Resin; Phenol-sulfuric Acid Method

復(fù)方苦參注射液是由苦參和白土苓經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)方法精制而成的中藥注射液，具有清熱利濕、涼血解毒、散結(jié)止痛的功效，用于癌腫疼痛、出血[1]。迄今為止，復(fù)方苦參注射液的研究主要集中在生物堿及黃酮類成分[2]，對(duì)于糖類物質(zhì)的研究相對(duì)較少。近年來(lái)，中藥糖類作為一類生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]、抗肺癌[7]等多種功能，已成為研究的熱點(diǎn)。本研究對(duì)復(fù)方苦參注射液總糖純化方法進(jìn)行優(yōu)選，測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，為復(fù)方苦參注射液再評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent Cary60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);T9北京普析紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);XSE 205 DU分析天平（METTLER TOLEDO）;TLE 204/02分析天平（METTLER TOLEDO）;HH-6D1恒溫水浴鍋（常州市美特儀器有限公司）;Mill-Q 超純水制備系統(tǒng)（Millipore公司）。

1.2 材料 大孔吸附樹(shù)脂（HPD100、AB-8、D 101，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所），濃硫酸（批號(hào)：20180428，北京化工廠）;乙醇（批號(hào)：20161128，北京化工廠）;苯酚（批號(hào)：C1927002，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司）;碳酸氫鈉（批號(hào)：20171104，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司）;D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：110833-201707，中國(guó)食品藥品檢定研究院）;復(fù)方苦參注射液（批號(hào)：20171102、20171128、20180301、20161032、20181203、20181204、20181209、20181212、20181213、20181214、20181215、20181138、20181139、20181034，山西振東制藥股份有限公司）。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore 超純水制備系統(tǒng)下制備的純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 葡萄糖對(duì)照品溶液制備 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖適量，加水溶解，配成1 mg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.1.2 5%苯酚溶液的制備 稱取苯酚100 g，加碳酸氫鈉0.05 g，置于250 mL圓底燒瓶中，常壓蒸餾，接收180 ℃餾分，用包覆鋁箔的三角瓶收集，放置陰涼干燥處，備用;稱取此餾分苯酚5 g，加水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得5%苯酚溶液，備用[8]。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取復(fù)方苦參注射液10 mL至50 mL量瓶中，用水稀釋刻度，搖勻，精密量取稀釋液5 mL進(jìn)行上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為3BV，收集濾出液至100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取樣品溶液及對(duì)照品稀釋溶液（濃度約為60 μg/mL）各1.0 mL，分別置于15 mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液 1.0 mL，充分振搖后迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，迅速移至80℃水浴中保溫10 min，冰浴中冷卻3 min，于紫外分光光度計(jì)在190～800 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

2.3 樣品檢測(cè)方法 精密量取樣品溶液1.0 mL，空白取1.0 mL蒸餾水，分別置15 mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液 1.0 mL，充分振搖后迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，迅速移至 80 ℃水浴中保溫 10 min，冰浴中冷卻3 min，于487 nm處測(cè)定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。

2.4 樣品純化方法確定

2.4.1 直接稀釋法樣品制備 分別精密量取復(fù)方苦參注射液（20171128、20180301、20161032）各1 mL，至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 大孔吸附樹(shù)脂純化樣品 分別精密量取復(fù)方苦參注射液（20171128、20180301、20161032）各1 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品制備，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)下表1。

大孔吸附樹(shù)脂純化總糖之后，經(jīng)苯酚-硫酸法顯色在紫外分光光度計(jì)下測(cè)得的總糖水洗部分約占92%左右，醇洗部分約占8%，考慮到糖類物質(zhì)不溶于乙醇的特性，推測(cè)醇洗部分應(yīng)為苷類物質(zhì)，所測(cè)得的糖為苷類物質(zhì)在硫酸作用下酸水解的糖或糖鏈，所以用直接稀釋法測(cè)得的總糖含量存在一定的偏差，而采用大孔吸附樹(shù)脂純化總糖的方法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中的總糖準(zhǔn)確可靠。

2.5 樣品純化方法優(yōu)化

2.5.1 不同型號(hào)大孔樹(shù)脂考察實(shí)驗(yàn) 分別取預(yù)處理后的3種型號(hào)大孔樹(shù)脂（AB-8、HPD100、D101 ）進(jìn)行濕法裝柱，柱容積為15 mL，精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）5 mL，依次進(jìn)行上樣，每根柱子上樣4次，接其殘留液至molish反應(yīng)呈陽(yáng)性后上樣液距大孔樹(shù)脂頂端0.5 cm，用水洗脫，接其洗脫液，洗至molish反應(yīng)呈陰性，然后測(cè)各殘留液、水洗液中總糖的含量。由表2可知，AB-8大孔吸附樹(shù)脂相比較其他型號(hào)樹(shù)脂，比吸附量最高，比洗脫量最高，并且洗脫率為100.34%，表明樹(shù)脂中未有其他物質(zhì)被洗脫出，故確定所用大孔吸附樹(shù)脂型號(hào)AB-8。

2.5.2 大孔吸附樹(shù)脂AB-8泄漏曲線考察 取預(yù)處理后的大孔吸附樹(shù)脂AB-8進(jìn)行濕法裝柱，柱高為15 cm，精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）5 mL，進(jìn)行上樣，上樣四次，接其流出液每0.5 mL進(jìn)行分裝，精密量取分裝流出液0.2 mL至20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下檢測(cè)方法進(jìn)行吸光度測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果表明AB-8大孔吸附樹(shù)脂最大上樣量為注射液原液3.5 mL，故暫定為注射液上樣量為1mL。如圖1所示。

2.5.3 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）1 mL，平行量取3份，分別加水稀釋5、3、1倍的樣品濃度進(jìn)行上樣，吸附2h，用水進(jìn)行洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為6BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明注射液稀釋5倍時(shí)，最接近樣品中含量，故上樣濃度定為稀釋5倍之后上樣。見(jiàn)表3。

2.5.4 吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）1 mL，平行量取3份，加水稀釋5倍上樣，分別吸附0、2、4 h，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為6 BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明各樣品吸附時(shí)間RSD為1.34%，無(wú)顯著性差異，表明吸附時(shí)間對(duì)復(fù)方苦參注射液總糖分離無(wú)影響，故選擇不進(jìn)行吸附，直接洗脫。見(jiàn)表4。

2.5.5 洗脫速度對(duì)解吸效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）1mL，平行量取3份，加水稀釋5倍上樣，用6BV水洗脫，洗脫流速分別為0.283，0.566，1.132 mL/cm2·min，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明樣品洗脫濃度為0.566 mL/cm2·min時(shí)，洗脫樣品含量最高，故洗脫速度定為0.566 mL/cm2·min。見(jiàn)表5。

2.5.6 洗脫濃度對(duì)解吸效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）1 mL，加水稀釋5倍上樣，分別用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇進(jìn)行洗脫，用量為6BV，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，分別收集流出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明只有水洗脫流出液中含有糖，故用純水進(jìn)行洗脫即可。如圖2所示。

2.5.7 水洗脫體積對(duì)解吸效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液（20171102）1 mL，加水稀釋5倍上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，分別收集洗脫體積為1、2、3、4、5、6、7、8的濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明3BV之后各洗脫體積中總糖含量之間RSD為0.77%，無(wú)明顯差異，故洗脫體積定為3BV。如圖3所示。

3 復(fù)方苦參注射液總糖含量測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)

按照確定的條件分別依次進(jìn)行專屬性、精密度、線性與范圍、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐用性及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

3.1 專屬性 分別取空白溶液、樣品溶液及對(duì)照品溶液在300～700 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示葡萄糖對(duì)照溶液與復(fù)方苦參注射液樣品溶液最大吸收波長(zhǎng)一致，均為487 nm，且空白溶液在最大吸收波長(zhǎng)487 nm處無(wú)干擾。如圖4所示。

3.2 精密度 精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL，按2.3項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.06%，儀器精密度良好。

3.3 線性與范圍 精密量取2.1.1項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.7、1.1、1.5、1.9、2.3 mL，于 25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，得濃度依次為28.06、44.09、60.12、76.15、92.18 μg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0102x+0.0473（r=0.9997），表明無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在28.06～92.18 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 重復(fù)性 取同一批號(hào)樣品（20181034）6份，分別按2.1.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再分別取供試品溶液1 mL，按2.3項(xiàng)下方法操作，RSD=1.51%，表明該含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性 樣品溶液顯色后在室溫分別放置0、30、60、90、120、150、180 min后按2.3項(xiàng)下方法操作，在0～180 min內(nèi)樣品含量結(jié)果RSD為0.72%，說(shuō)明樣品在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 耐用性 考察改變測(cè)定波長(zhǎng)（±2nm）、儀器（型號(hào)）條件，計(jì)算復(fù)方苦參注射液總糖含量RSD，耐用性RSD為0.31%，表明方法耐用性良好。

3.7 回收率 精密量取復(fù)方苦參注射液（20181034）4 mL至20 mL量瓶中，精密稱定D-無(wú)水葡萄糖（約為1倍樣品中總糖質(zhì)量）172.37 mg加入上述量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取2.5 mL上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·h，用量為3BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，平行制備6份，按2.3項(xiàng)下方法檢測(cè)，結(jié)果表明樣品回收率96.84%～104.46%，RSD為2.58%，方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表6。

加樣回收率（%）=（檢測(cè)總量-樣品含量）/加標(biāo)量×100%。

3.8 樣品測(cè)定 取復(fù)方苦參注射液樣品（20181203、20181204、20181209、20181212、20181213、20181214、20181215、20181138、20181139、20181034）按2.1.3項(xiàng)下樣品制備方法制備，按按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算復(fù)方苦參注射液總糖含量。見(jiàn)表7。

4 結(jié)論

中藥一般含有大量的糖和苷類成分，本產(chǎn)品采用大孔對(duì)脂進(jìn)行純化，將除去苷類等干擾成分，結(jié)果可靠。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較大孔樹(shù)脂AB-8、HPD100、D101三種不同的大孔吸附樹(shù)脂的比吸附率與比洗脫率，發(fā)現(xiàn)AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)復(fù)方苦參注射液的總糖的純化效果最佳，通過(guò)對(duì)泄露曲線、上樣濃度、吸附時(shí)間、洗脫速度、洗脫濃度、洗脫體積綜合考察確定復(fù)方苦參注射液總糖的最佳工藝為復(fù)方苦參注射液1 mL，稀釋5倍，在床容積（BV）為15 mL的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱進(jìn)行上樣，用3BV水洗脫。

采用經(jīng)典的苯酚硫酸法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中糖的大類成分，實(shí)驗(yàn)表明糖含量約占總固量的50%左右，主要是單糖和寡糖。《中藥注射液安全性再評(píng)價(jià)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)技術(shù)原則（試行）》中明確指出，注射劑中所含成分應(yīng)基本清楚，對(duì)注射液總固體中所含成分要進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)研究，明確總固體中所含大類成分的種類及占總固體的量[9]。實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方苦參注射液中的糖類成分進(jìn)行了分析測(cè)定，有利于復(fù)方苦參注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和保證臨床用藥安全。

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（收稿日期：2021-03-18 編輯：陶希睿）