環境因素對人類疾病調控作用機制研究

謝明仁, 盧建珍, 王賢賢, 謝劉陽, YU Xin, 俞發榮,*

環境因素對人類疾病調控作用機制研究

謝明仁1, 盧建珍1, 王賢賢1, 謝劉陽1, YU Xin2, 俞發榮1,*

1. 甘肅政法大學 公安技術學院, 蘭州 730070 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas, 77030, US

為了探索環境因素對人類疾病調控作用機制, 研究植物提取物二十碳烯酸對人食管癌細胞(EC56細胞)PI3K-Akt信號通路調控基因表達水平的影響, 分別給予EC56細胞 0.2,0.8,1.6 mg·L-1二十碳烯酸和5-FU培養48 h。用流式細胞儀檢測EC56細胞凋亡率; 用酶聯免疫吸附法(ELISA法)檢測EC56細胞中腦源性神經營養因子(BDNF)、酪氨酸激酶受體B(TrkB)、粘著斑激酶(FAK)、蛋白激酶(Akt)表達水平。結果發現, 給予EC56細胞二十碳烯酸和5-FU培養48 h, 細胞凋亡率為15.46%, 21.52%, 23.13%和18.34, 與對照組比較, 細胞凋亡率有顯著性差異(<0.01); BDNF、TrkB水平比對照組分別降低了22.76%, 43.90%, 56.91%, 40.65%和22.59%, 43.49%, 67.76%, 49.28%(<0.01); FAK和Akt水平比對照組分別降低了14.34%, 36.49%, 50.7%, 49.7% 和15.11%, 24.99%, 32.71%, 20.84%。結果提示, 植物提取物二十碳烯酸對EC56細胞增殖具有明顯的抑制作用,其作用機制與PI3K-Akt信號轉道通路中調控基因TrkB、BDNF、FAK和Akt表達水平下調和抑制EC56細胞分裂周期有關。實驗結果為充分利用自然環境資源, 協調生態環境平衡, 提高人類身心健康研究提供了參考依據。

二十碳烯酸; 人食管癌細胞; 細胞分裂周期; 凋亡; PI3K-Akt信號通路

0 前言

人類生活在自然生態環境中, 人類的健康無時無刻不受自然環境因素的影響。當人類的活動影響或使生態環境平衡遭到破壞, 就直接或間接威脅人類健康, 誘發疾病生成。腦源性神經營養因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶受體B(TrkB) 在多種人體腫瘤中均有異常表達[1],在腫瘤發生、發展[2]和轉移[3]過程中具有重要功能。TrkB介導的信號轉導與腫瘤的發生發展密切相關,因此,阻斷或者抑制TrkB活性, 可破壞腫瘤細胞的信號傳遞,從而達到抗腫瘤的目的[4]。以磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和其下游分子蛋白激酶(Akt)所組成的信號轉導通路關鍵分子為靶點的腫瘤治療研究發現, PI3K-Akt信號通路與人類腫瘤的發生發展密切相關。該通路調節腫瘤細胞的增殖和存活,其活性異常不僅能導致細胞惡性轉化,在組織血管生成和細胞生長,增殖,新陳代謝, 遷移, 分化和凋亡過程中起著至關重要的作用[5]。PI3K-Akt信號轉導通路受BDNF、TrkB、局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)基因的調控。當BDNF、TrkB、FAK表達上調時, PI3K-Akt被激活[6], 促進細胞增殖[7]、遷移[8], 抑制細胞凋亡[9]。根據BDNF, TrkB, FAK在PI3K-Akt信號轉導通路中調節特點, 在前期研究[10]的基礎上, 將二十碳烯酸給予人食管癌細胞(EC56), 研究分析對PI3K- Akt信號轉導通路中相關調控基因的作用, 為進一步研究環境因素對人類疾病調控作用及其機制積累資料。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

二十碳烯酸, 蘭州大學化工學院天然植物研究所提供, 由中國科學院蘭州化學物理研究所進行質量鑒定; 5-氟尿嘧啶( 5-FU), 批號20190306, 規格: 每支 5 mL, 南通精華制藥有限公司生產; 二甲基亞砜(DMSO), 蘇州聯雄化工科技公司生產; 胎牛血清, 鄭州九龍生物制品有限公司提供。腦源性神經營養因子(BDNF)試劑盒、酪氨酸激酶受體B(TrkB)試劑盒, 局部粘著斑激酶(FAK)試劑盒, 蛋白激酶(Akt)試劑盒, 購于北京索寶生物科技有限公司。

1.2 儀器

MULTISKAN MK3酶標儀, 上海雷勃分析儀器有限公司; 流式細胞儀, Coulter EPICS XL型, USA; ZHJH-C1112B型雙人單面百級超凈工作臺, 上海智城分析儀器制造有限公司; 3552-2型全自動高溫滅菌CO2培養箱, SHELDON MFG INC.; Olympus數碼顯微鏡, 奧林巴斯(中國)投資有限公司; 100X-640X倒置顯微鏡, 北京佳源興業科技有限公司; 96孔板, USA.

1.3 人食管癌細胞(EC56)

甘肅省醫學科學研究院藥理毒理實驗中心惠贈。

2 實驗方法

2.1 人食管癌細胞(EC56)培養

將EC56細胞加入含RPMI1640培養液、10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素的培養瓶中, 放入CO2培養箱中傳代培養。

2.2 分組和給藥

取EC56細胞(細胞密度為2×106個·L–1)接種于96孔培養板, 每孔90 μL。給藥組分為低劑量組(L): 每孔加入0.2 mg·L–1二十碳烯酸 10 μL; 中劑量組(M): 每孔加入0.8 mg·L–1二十碳烯酸 10 μL; 高劑量組(H): 每孔加入1.6 mg·L–1二十碳烯酸 10 μL; 5-FU組: 每孔加5-FU(10 mg·L–1)10 μL; 對照組: 每孔加DMSO(30 μL·L–1)10 μL。各設4個重復孔。5%CO2, 37℃, 飽和濕度條件中培養48 h, 用酶標儀在450 nm波長下檢測各組細胞吸光度(OD), ELISA法測BDNF、TrkB、FAK、Akt表達水平。

2.3 二十碳烯酸對EC56細胞分裂周期影響

取EC56細胞2 mL, 加入含RPMI1640液6 mL的培養瓶,給藥組分別加入二十碳烯酸 0.2,0.8, 1.6·L-1和5-Fu各0.8 mL; 對照組加DMSO(30 μL·L-1)0.8 mL, 培養48 h, 離心收集細胞, 用流式細胞儀檢測分裂期細胞數和細胞凋亡率。

2.4 直線回歸方程制作

取BDNF, TrkB, FAK, Akt試劑盒中標準品50 uL分別加入酶標板, 用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值), 以標準品的濃度為橫坐標, 對應的吸光度(OD值)為縱坐標計算出標準曲線的直線回歸方程。

2.5 統計學處理

實驗數據采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。計數資料用百分率(%)表示, 組間比較用單因素方差分析, 以<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 二十碳烯酸對EC56細胞分裂周期的影響

L、M、H濃度二十碳烯酸組和5-FU組EC56細胞用流式細胞儀測得凋亡率分別為15.46%, 21.52%, 23.13%和18.34%, 二十碳烯酸組和5-FU組細胞的凋亡率比對照組顯著升高(<0.01); H組比5-FU組細胞凋亡率顯著升高(<0.01), 見表1。

Tabel 1 The effect of eicosenoic acidon EC56 cells division cycle

表1 二十碳烯酸對EC56細胞分裂周期的影響

與對照組比:**<0.01; 與5-FU組比:▼<0.05,▼▼<0.01。

3.2 二十碳烯酸對EC56細胞BDNF表達水平的影響

BDNF標準曲線的直線回歸方程為:=1.1× 10-3+1.15×10-2,2=0.9997。L、M、H組和5-FU組的BDNF水平分別為215.91±1.33, 156.82±1.24, 120.45±1.04和165.91±2.03, 比對照組BDNF水平(279.55±2.07)分別降低了22.76%, 43.90%, 56.91%和40.65% (<0.01)。見圖1。

3.3 二十碳烯酸對EC56細胞TrkB表達水平的影響

TrkB標準曲線的直線回歸方程為:=1.1× 10-3+1.33×10-2,2=0.9998。L、M、H組和5-FU組的TrkB水平分別為171.36±2.12, 125.91±1.97, 71.36±1.53和112.27±2.81, 比對照組TrkB水平(221.36±1.65)分別降低了22.59%, 43.49%, 67.76%和49.28%(<0.01)。見圖2。

3.4 二十碳烯酸對EC56細胞FAK表達水平的影響

FAK標準曲線的直線回歸方程為:=1.5× 10-2+1.1×10-2,2=0.9994。L、M、H組和5-FU的FAK水平分別為72.06±0.41, 53.42±0.19, 41.47±0.18和42.31±0.33, 比對照組FAK水平(84.12±0.22)分別降低了14.34%, 36.49%, 50.70%和49.70%。見圖3。

3.5 二十碳烯酸對EC56細胞Akt表達水平的影響

Akt標準曲線的直線回歸方程為:=1.19×10-2+ 2.32×10-2,2=0.9996。L、M、H組和5-FU組的Akt水平分別為52.14±0.32, 46.07±0.45, 41.33± 0.53和48.62±0.22, 比對照組Akt水平(61.42±0.36)分別降低了15.11%, 24.99%, 32.71%和20.84%。見圖4。

圖1 二十碳烯酸對EC56細胞BDNF表達水平的影響(與C比: **P<0.01)

Figure 1 Effect ofeicosenoic acid on BDNF expression level in EC56 cells(**<0.01C group)

圖2 二十碳烯酸對EC56細胞TrkB表達水平的影響(與C比: **P<0.01)

Figure 2 Effect ofeicosenoic acid on TrkB expression level in EC56 cells(**<0.01C group)

圖3 二十碳烯酸對EC56細胞FAK表達水平的影響(與C比: *P<0.05, **P<0.01)

Figure 3 Effect ofeicosenoic acid on FAK expression in EC56 cells(*<0.05,**<0.01C group)

圖4 二十碳烯酸對EC56細胞Akt表達水平的影響(與對照組比: *P<0.05, **P<0.01)

Figure 4 Effect of eicosenoic acid on Akt expression in EC56 cells(*<0.05,**<0.01C group)

4 討論

研究報道, 酪氨酸激酶受體介導的信號轉導與腫瘤的發生發展密切相關, 酪氨酸激酶受體可促進多種腫瘤[11]的生長、侵襲、轉移。因此, 抑制酪氨酸激酶受體活性, 可阻斷腫瘤細胞的信號傳遞, 抑制腫瘤形成, 從而達到抗腫瘤的目的[4]。提示酪氨酸激酶受體可能成為抗腫瘤治療的潛在靶點,酪氨酸激酶受體抑制劑的應用可能成為抗腫瘤治療的新策略[12]。李坤等[13]研究發現, 給予神經母細胞瘤(NB)細胞全反式維甲酸(ATRA)和腦源性神經營養因子(BDNF), 誘導酪氨酸激酶受體B(TrkB)高表達, TrkB進一步激活其下游PI3K /Akt通路, 促進NB細胞合成、分泌血管內皮生長因子(VEGF); 若給予酪氨酸蛋白激酶抑制劑(K252a)阻斷TrkB-BDNF信號通路或給予PI3K 抑制劑(LY294002)阻斷TrkB-BDNF信號下游通路PI3K/Akt均可有效抑制NB細胞合成分泌VEGF[14]。粘著斑激酶(FAK) 是細胞內一種非受體酪氨酸激酶, 在多種腫瘤細胞中均出現異常表達量[15], 在細胞存活[16]、粘附、遷移多種細胞信號通路中起著關鍵作用[17]。當FAK被激活時, 腫瘤細胞增殖、侵襲活性增加, 抑制細胞凋亡[9]。給予FAK抑制劑, 發現FAK表達或活性阻斷使細胞增殖受到顯著抑制, 這種抑制主要體現在G2/M期細胞比率的增加及S期細胞比率的下降[18]。上述研究成果表明, TrkB、BDNF、FAK水平調節控制著PI3K/Akt信號轉道通路的活性。羅紅[19]將二十碳五烯酸單獨或聯合視黃酸給予HL-60細胞, 細胞增殖抑制率為 24.38%或42.75 %, 可見二十碳五烯酸可抑制 HL- 60細胞增殖和誘導其分化, 與視黃酸聯合應用效果更為明顯, 這種聯合效應可能與二十碳五烯酸減緩 HL-60細胞內視黃酸的代謝相關。沈桂芬[20]將由細胞色素P450表氧化酶從花生四烯酸合成環氧化二十碳三烯甘油酸給予人舌癌細胞(Tca-8113)培養72 h, S期和G2/M期細胞比對照組明顯增多, Akt磷酸化水平顯著增加, 表明PI3K/Akt細胞轉導通路在細胞增殖過程中起重要作用。在前期實驗中, 將十二碳稀酸[21], 十八碳稀酸[22], 不飽和脂肪酸(含二十碳稀酸)[23]分別給予不同腫瘤細胞, 結果發現均有抑制細胞增殖、促進細胞凋亡的作用, 但對其作用機制討論較少。本文實驗結果發現, 給予EC56細胞二十碳烯酸處理后, TrkB、BDNF、FAK和Akt表達水平明顯下調, 細胞凋亡率隨給藥劑量的增加而升高, 其中G0/G1細胞比例增加, G2/M細胞比例明顯減少, 進入M期的細胞減少, 細胞分裂增殖被抑制。實驗結果與上述文獻報道結果一致。結果提示, 二十碳稀酸對人食管癌細胞增殖具有明顯的抑制作用, 其作用機制與抑制PI3K-Akt信號轉道通路中調控基因TrkB、BDNF、FAK和Akt表達水平和抑制人食管癌細胞分裂周期有關。實驗結果為充分利用自然環境資源, 協調生態環境平衡, 提高人類身心健康研究提供了參考依據。

[1] 竇維佳, 王景杰, 劉震雄. 胃癌中BDNF的表達特征及其臨床意義[J]. 山西醫科大學報, 2018, 49(4): 383–386.

[2] 劉志, 陶自堅. 受體酪氨酸激酶Eph基因與腫瘤微環境及相關治療的研究進展[J]. 臨床與實驗病理學雜志, 2017, 33(11): 1241–1244.

[3] 呂博, 陳艷華. TrkB與腫瘤侵襲轉移的研究進展[J]. 中國醫藥指南, 2015, 13(5): 47–48.

[4] 謝蒙蒙, 李瑩文, 周吳, 等. 受體酪氨酸激酶ROS在腫瘤中作用的研究進展[J]. 腫瘤藥學, 2016, 6(3): 166–172.

[5] POMAR S C, ARCARO A. The role of the PI3K/AKT/mTOR pathway in brain tumor metastasis[J]. Journal of Cancer Metastasis and Treatment, 2016, 2 (11): 80–89.

[6] SUN BG, MENG J, XIANG T, et al. Jianpijiedu fang improves survival of hepatocarcinoma mice by affecting phosphatase and tensin homolog, phosphoinositide 3-kinase, and focal adhesion kinase[J]. Journal of Tradiional Chinese Medicine, 2013, 33(4): 479–485.

[7] YU R, YU BX, CHEN JF, et al. Anti-tumor effects of Atractylenolide I on bladder cancer cells[J]. Journal of Experimental Clinical Cancer Research, 2016, 35(40): 1–10.

[8] 李博, 鄧睿, 李棟, 等. 結腸癌組織中SphK1和FAK表達量與臨床病理特征、上皮間質轉化的相關性研究[J]. 海南醫學院學報, 2018, 24(2): 202–205, 209.

[9] 李吉友, 賈棟. 抑制FAK的表達對人胃癌細胞SGC–7901凋亡的影響[J]. 現代腫瘤醫學, 2017, 25(1): 34–37.

[10] 俞發榮, 連秀珍, 謝明仁, 等. 2-十二烯酸對人肝癌細胞毒性作用研究[J]. 中國臨床藥理學雜志, 2014, 30(12): 1108– 1110, 1123.

[11] 張義朋, 黃華艷, 仰昳婕, 等. 受體酪氨酸激酶AXL在腫瘤耐藥中的作用研究進展[J]. 上海交通大學學報(醫學版) , 2018, 38(7): 819–824.

[12] 唐小崧, 陳公琰. 受體酪氨酸激酶AXL在腫瘤中的研究進展[J]. 實用腫瘤學雜志, 2017, 31(3): 281–284.

[13] 李坤霞, 李愛敏, 張繼紅. TrkB-BDNF信號通路對神經母細胞瘤細胞分泌血管內皮生長因子的影響[J]. 中國當代兒科雜志, 2011, 13(3): 240–243.

[14] 劉建英. TrkB-BDNF的三條下游信號傳導通路對神經母細胞瘤細胞耐藥的影響[J]. 泰山醫學院學報, 2013, 34(3): 179–182.

[15] LIN H M, BRIAN Y L, CASTILLO L, et al. Effect of FAK inhibitor VS–6063 (defactinib) on docetaxel efficacy in prostate cancer[J]. The Prostate, 2018, 78(4): 308–317.

[16] 楊超, 陳穎, 田巍, 等. 黏著斑激酶及其小分子抑制劑作為抗腫瘤藥物的研究進展藥學進展[J]. 2014, 38 (9): 649–655.

[17] 陳瑛, 王丹丹, 朱虹, 等. 抗腫瘤新靶點黏著斑激酶FAK及其抑制劑研究進展[J]. 中國現代應用藥學, 2016, 33 (2): 255–260.

[18] THIYAGARAJAN V, TSAI M J, WENG C F. Antroquinonol targets FAK-Signaling pathway suppressed cell migration, iInvasion, and tumor growth of C6 glioma[J]. Plos one, 2015, 10(10): 1–14.

[19] 羅紅, 糜漫天, 張乾勇, 等. 二十碳五烯酸聯合視黃酸對HL-60細胞增殖與分化功能的影響[J]. 免疫學雜志, 2001, 17(5): 331– 333, 343.

[20] 沈桂芬, 蔣建剛, 付向寧, 等. 環氧化二十碳三烯甘油酸對腫瘤細胞增殖的影響[J]. 癌癥, 2008, 27(11): 1130– 1136.

[21] 俞發榮, 連秀珍, 謝明仁, 等. 十二碳烯酸對人H4細胞毒性作用研究[J]. 中國現代應用藥學, 2014, 31(2): 134– 136.

[22] 俞發榮, 楊博, 連秀珍, 等. 十八碳烯酸對人MGC-803細胞毒性作用機制研究[J]. 中國藥理學通報, 2017, 33(6): 887–888.

[23] 俞發榮, 李建軍, YU Xin, 等. 不飽和脂肪酸對人胃癌細胞PI3K-Akt 信號通路中相關基因表達的影響[J]. 生態科學, 2019, 38(6): 60–63.

The mechanism of environmental factors on the regulation of human diseases

XIE Mingren1,LU Jianzhen1,WANG Xianxian1, XIE Liuyang1, YU Xin2, YU Farong1,*

1. School of Public Security Technical, Gansu University of Political Science and Law, Lanzhou 730070, China 2. Baylor College of Medicine, Houston, Texas,77030, US

In order to explore the regulatory mechanism of environmental factors on human diseases, the effects of plant extract eicosaenoic acid on regulatory gene expression level of PI3K-Akt signaling pathway in human esophageal cancer cells (EC56 cells) were studied. EC56 cells were cultured with 0.2,0.8,1.6 mg·L-1eicosaenoic acid and 5-FU for 48 h. The apoptosis rate of EC56 cells was detected with flow cytometry; expression levels of brain-derived neurotrophic factor (BDNF), tyrosine kinase receptor B (TrkB), adhesion spot kinase (FAK) and protein kinase (Akt) in EC56 cells were determined by ELISA. The results showed that the apoptosis rate was 15.46%, 21.52%, 23.13% and 18.34; compared with the control group, the apoptosis rate was significantly different (<0.01). The levels of BDNF and TrkB decreased by 22.76%, 43.90%, 56.91%, 40.65% and 22.59%, 43.49%, 67.76%, 49.28%, respectively (<0.01). The levels of FAK and Akt decreased by 14.34%,36.49%,50.7%,49.7% and 15.11%, 24.99%, 32.71%, 20.84%, respectively. The results indicated that plant extracts eicosaenoic acid had a significant inhibitory effect on the proliferation of EC56 cells, and its mechanism was related to the down-regulation of the expression levels of the regulatory genes TrkB, BDNF, FAK and Akt in the PI3K-Akt signaling pathway and the inhibition of the EC56 cell division cycle. The experimental results provide a reference for the research of making full use of natural resources, coordinating the balance of ecological environment and improving the physical and mental health of human beings.

eicosenoic acid; human esophageal cancer cells; cell division cycle; apoptosis; PI3K-Akt signaling pathway

10.14108/j.cnki.1008-8873.2020.06.022

R915

A

1008-8873(2020)06-175-06

2020-04-05;

2020-04-24

甘肅省高校科技創新團隊項目(2016C-09); 蘭州市科技計劃項目(2015-3-80; 2019-1-48); 甘肅政法大學省級特色學科建設項目; 甘肅政法大學重點項目(2016XZDLW04)

謝明仁(1977—), 男, 甘肅民勤人, 碩士, 副教授, 物證技術專業碩士生導師, 主要從事物證技術教學與研究, E-mail:xmr6700@gsli.edu.cn

俞發榮, 男, 博士, 研究員, 主要從事環境因素與人類健康的關系、藥理毒理學研究, E-mail: tim9898@163.com

謝明仁, 盧建珍, 王賢賢, 等. 環境因素對人類疾病調控作用機制研究[J]. 生態科學, 2020, 39(6): 175–180.

XIE Mingren, LU Jianzhen, WANG Xianxian, et al. The mechanism of environmental factors on the regulation of human diseases[J]. Ecological Science, 2020, 39(6): 175–180.