β2-AR別構拮抗劑Cmpd 15關鍵中間體(S)-9-芴基甲氧羰基-4-甲酰胺基苯丙氨酸的合成

趙 帥, 芮 雪, 錢明成, 陳 新

(常州大學 藥學院，江蘇 常州 213164)

G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)是體內最龐大的蛋白質超家族，目前已經有2000多種不同的GPCRs被報道[1-2]。G蛋白偶聯受體通過與細胞周圍環境中的配體結合從而激活細胞內的一系列信號通路，引起細胞狀態的改變，參與了人體內幾乎全部生理病理和藥理過程[3]。其功能與多種疾病有關，如心血管類疾病、神經系統疾病、炎癥疾病、代謝性疾病、癌癥等。目前，超過40%的現代藥物直接或間接靶向GPCRs[4]。

β腎上腺素受體(β-AR)是研究最深入的GPCRs之一[5-6]。其中,β2-AR在支氣管平滑肌、心血管和肺部都有廣泛表達，在調節心血管系統各項活動中扮演著至關重要的作用。目前市售β2-AR激動劑和拮抗劑較多，如沙丁胺醇(salbutamol)、特布他林(terbutaline)、沙美特羅(salmeterol)、福莫特羅(formoterol)和普萘洛爾(propranolol)等[7]。值得注意的是，上述β2-AR藥物皆為正構配體，由于正構配體的高度保守性和受體基因序列的高度同源性，這些正構配體存在受體亞型選擇性差、神經系統不良反應和禁忌癥較多等問題[8]。與之相比，在空間和拓撲結構上，與正構結合位點不同的其他區域相結合的別構配體，因具有更高的受體亞型選擇性而成為藥物研發的熱點[9-14]。目前，已報道的β2-AR別構調節劑有別構激動劑Cmpd6FA[15]和別構拮抗劑Cmpd15[16]。其中，Cmpd15的結構于2017年由本課題組與美國合作者共同報道(Chart 1)[17]。如圖所示，Cmpd15可以由3個片段A～C偶聯得到。其中片段A廉價易得，片段C的合成已由本課題組報道[18-19]。然而片段B對甲酰基取代的L-苯丙氨酸十分昂貴(7200元/g，安耐吉化學)，不利于后續進行的Cmpd15衍生物的合成研究。

Chart 1

本文從二苯亞胺甘氨酸叔丁酯(2)和對甲酰胺芐溴(3)出發，經過不對稱烷基化、水解、脫保護基和酰胺化等多步反應成功合成了Fmoc保護的片段B，即化合物12。通過在其羧酸端引入長鏈的聚乙二醇羧酸酯結構，成功測得了其ee值(97%)(Scheme 2),產物結構經1H NMR,13C NMR和HR-MS(ESI)確證。

Scheme 1

Scheme 2

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Autopol IV型旋光儀；Bruker 300/400 MHz型核磁共振儀(TMS為內標)；Thermo Orbitrap Elite型質譜儀；Agilent 1260型高效液相色譜儀。

化合物1[20]、2[19]、3[21]和13[22]按文獻方法合成；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)4-溴甲基苯甲酸芐酯(6)的合成

在250 mL單口燒瓶中，加入4-溴甲基苯甲酸5(6.0 g, 27.9 mmol)和氯化亞砜(18 mL)，回流反應3 h。冷卻至室溫，濃縮除去過量氯化亞砜，將苯甲醇(24 mL)和NaHCO3(7.0 g, 83.7 mmol)加入濃縮液中，攪拌5 h。抽濾，濾液濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=100/1]純化得白色固體6(8.3 g，收率98%);1H NMR(CDCl3, 300 MHz)δ: 8.04(d,J=8.4 Hz, 2H), 7.32～7.45(m, 7H), 5.36(s, 2H), 4.47(s, 2H);13C NMR(CDCl3, 75 MHz)δ: 165.9, 142.9, 136.0, 130.3, 130.1, 129.1, 128.7, 128.4, 128.3, 66.9, 32.3。

(2)(S)-4-(3-(叔丁氧基)-2-((二苯基亞甲基)氨基)-3-氧亞基)苯甲酸芐酯(7)的合成

(3)(S)-4-(3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧亞基)苯甲酸芐酯(8)的合成

將(S)-4-(3-(叔丁氧基)-2-((二苯基亞甲基)氨基)-3-氧亞基)苯甲酸芐酯7(1.0 g, 1.93 mmol)溶于四氫呋喃(17 mL)中，降溫至0 ℃，滴加1 M HCl溶液(17 mL)，滴畢，于0 ℃反應1 h。加入飽和碳酸氫鈉溶液(10 mL)淬滅反應，用10% Na2CO3溶液調節pH至7～9，減壓濃縮，殘余物加入水(40 mL)，用乙酸乙酯(3×40 mL)萃取，合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，粗產物溶于7 mL無水四氫呋喃中，于0 ℃滴加三乙胺(403 μL, 2.9 mmol)和二碳酸二叔丁酯(532 μL, 2.3 mmol)，滴畢，反應1 h。用水(40 mL)淬滅反應，加入乙酸乙酯(3×40 mL)萃取，合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，濃縮，粗產物經硅膠柱層析[洗脫劑:V(石油醚)/V(乙酸乙酯)=20/1]純化得白色固體8(800.4 mg, 91%)；1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 8.00(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.32～7.45(m, 5H), 7.25(d,J=7.2 Hz, 2H), 5.35(s, 2H), 5.04(d,J=4 Hz, 1H), 4.45～4.50(m, 1H), 3.06～3.17(m, 2H), 1.41(d,J=7.2 Hz, 18H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz)δ: 170.7, 166.4, 155.1, 142.2, 136.1, 129.8, 129.7, 128.8, 128.7, 128.3, 128.3, 82.5, 79.9, 66.8, 54.7, 38.6, 28.4, 28.1。

(4)(S)-4-(3-(叔丁氧基)-2-((叔丁氧基羰基)氨基)-3-氧亞基)苯甲酸(9)的合成

將化合物8(250.0 mg, 0.6 mmol)溶于甲醇(3 mL)中，加入鈀碳(37.5 mg, 15%)，通入氫氣,反應至終點。用硅藻土抽濾，濾餅濃縮得白色固體9(187.2 mg, 93%);1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 12.87(s, 1H), 7.85(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.34～7.38(m, 2H), 7.24(d,J=8 Hz, 1H), 3.96～4.09(m, 1H), 3.01(dd,J=13.7 Hz, 5.6 Hz, 1H), 2.88～2.94(m, 1H), 1.29～1.34(m, 18H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz)δ: 171.0, 167.3, 155.4, 143.1, 129.4, 129.2, 129.0, 80.5, 78.2, 55.6, 36.5, 28.1, 27.6。

(5)(S)-2-(((叔丁氧羰基)氨基)-3-(4-氨基甲酰基苯基)丙酸叔丁酯(10)的合成

氮氣保護下，將9(150.0 mg, 0.4 mmol)，N-羥基丁二酰亞胺NHS(61.2 mg, 0.5 mmol)和EDCI(103.3 mg, 0.5 mmol)溶于乙腈(5 mL)中，攪拌下反應12 h。濃縮，殘余物加入水(10 mL)，用二氯甲烷(3×10 mL)萃取，合并有機相，用無水硫酸鈉干燥，濃縮，殘余物用乙腈溶解，于0 ℃滴加氨水(1 mL)，滴畢，攪拌1 h。濃縮，殘余物加入水(10 mL)，用二氯甲烷(3×10 mL)萃取，合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮，殘余物經硅膠柱層析[洗脫劑:V(二氯甲烷)/V(甲醇)=20/1]純化得白色固體10(148.4 mg, 99%)；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 7.9(s, 1H), 7.79(d,J=8.0 Hz, 2H), 7.30(d,J=7.8 Hz, 2H), 7.20(d,J=8.0 Hz, 1H), 4.01～4.07(m, 1H), 2.99(dd,J=13.7 Hz, 5.4 Hz, 1H), 2.86～2.91(m, 1H), 1.30～1.35(m, 18H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz)δ: 171.1, 167.7, 155.4, 141.2, 132.4, 129.0, 127.4, 80.5, 78.2, 55.7, 36.3, 28.1, 27.6。

(6)(S)-4-甲酰胺基苯丙氨酸鹽酸鹽(11)的合成

將10(138.0 mg, 0.4 mmol)溶于二氯甲烷(2 mL)和甲醇(2 mL)中，通入氯化氫氣體，反應至終點(TLC監測)。減壓濃縮，殘余物加入少量乙酸乙酯，抽濾，濾餅用乙酸乙酯洗滌得白色固體11(79.1 mg, 85%)；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 8.57(s, 3H), 7.89(d,J=8.1 Hz, 2H), 7.42(d,J=8.1 Hz, 2H), 4.19(s, 1H), 3.23(dd,J1=21.1 Hz,J2=14.8 Hz, 2H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz)δ: 170.2, 140.3, 167.2, 129.8, 129.7, 129.5, 52.9, 35.5。

(7)(S)-9-芴基甲氧羰基-4-甲酰胺基苯丙氨酸(12)的合成

在25 mL的單口燒瓶中，加入化合物11(90.0 mg, 0.4 mmol)，1,4-二氧六環和10%碳酸鈉溶液，于0 ℃緩慢滴加Fmoc-Cl(95.2 mg, 0.4 mmol)的1,4-二氧六環(1 mL)溶液，滴畢，攪拌下于0 ℃反應4 h；升溫至室溫，反應16 h。用3 N鹽酸溶液酸化反應體系至pH=1，加入水(20 mL)，用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，合并有機相，依次用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓蒸餾，白色混合物加入少量乙酸乙酯，抽濾得白色粉末狀固體12(138.3 mg,產率87%)；1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 7.86(t,J=8.5 Hz, 4H), 7.77(d,J=8.5 Hz, 1H), 7.62(t,J=6.6 Hz, 2H), 7.38～7.42(m, 4H), 7.25～7.42(m, 2H), 4.14～4.24(m, 4H), 3.16(dd,J=13.7 Hz, 4.0 Hz, 1H), 2.91～2.97(m, 1H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz)δ: 170.8, 169.8, 169.5, 155.9, 143.9, 141.4, 141.2, 132.0, 129.7, 127.9, 127.8, 127.2, 125.2, 120.1, 82.1, 70.7, 70.5, 70.4, 70.2, 69.8, 68.9, 67.0, 56.1, 47.2, 39.4, 39.1, 28.2; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C25H22N2O5{[M+Na]+}453.1421, found 453.1424。

(8)(S)-5-(4-氨基甲酰基芐基)-1-(9-芴基甲酯)-3,6-二氧亞基-2,10,13,16-四氧亞基-4,7-二氮雜十八烷-18-酸酯(14)的合成

為了實現片段B簡潔高效的不對稱合成，首先嘗試使用對甲酰胺芐溴3與二苯亞胺甘氨酸叔丁酯2直接發生不對稱烷基化反應構建片段B。但是遺憾的是,反應體系非常復雜，且產物很少(Scheme 1)。可能原因之一是化合物3在有機溶劑中的溶解性非常差。因此將對甲酰胺芐溴3中的酰胺替換為酯基后，與二苯亞胺甘氨酸叔丁酯2發生不對稱烷基化反應。經過一系列篩選，最終選定了對甲酸芐酯取代的芐溴6作為反應底物。其中芐基可以通過催化氫化反應轉化為相應的羧酸，之后通過氨基化反應得到片段B中的甲酰胺取代基。

從商業可得的對甲酸芐溴5出發，經過兩步反應合成了所需的芐溴底物6。接下來芐溴6和二苯亞胺甘氨酸叔丁酯2在手性相轉移催化劑1的作用下，發生不對稱烷基化反應，以94%的產率和98%的ee得到了化合物7[20,23]。再經過亞胺水解和Boc保護得到化合物8。其中水解反應需要在0 ℃下進行，防止酯基同時被水解。化合物8發生催化氫化脫去芐基得到相應的羧酸9。化合物9經過胺化反應得到所需的含有對位甲酰胺取代基的化合物10。該步驟也可使用偶聯試劑HATU/EDCI和NH4Cl進行酰胺化，產率94%。再用鹽酸脫去Boc保護基得到片段B的鹽酸鹽化合物11，最后，將11進行Fmoc保護得到所需的12。由于12在有機溶劑中的溶解性很差，后處理可以用乙酸乙酯等有機溶劑進行多次洗滌，即可得到高純度的12。

接下來，嘗試測定此條路線合成的12的光學純度。發現由于12在常見的有機溶劑中溶解度很低，僅能少量溶解在DMSO中，難以使用HPLC測定其ee值。因此，在其羧酸端引入了一條聚乙二醇羧酸長鏈，得到了化合物14，大大提高了其溶解度，最終測得化合物14的ee值為97%，與化合物7的ee值接近，證明了此條路線的可靠性。

從對甲酸芐溴出發，經過不對稱烷基化反應，水解反應，胺化反應等10步反應合成了β2-AR別構拮抗劑Cmpd15的關鍵中間體片段B。此條合成路線產率高，對映選擇性較好(97%ee)。該研究為Cmpd15及其類似物的合成提供了一條高效可靠的路線。