不同光照強度對三葉青生長發育及其總黃酮的影響△

徐惠龍，劉江明，范小芳，許文，范世明

福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350122

三葉青系為葡萄科植物三葉崖爬藤TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg，主要分布于福建、浙江和廣西等南方省區[1]，以其塊根入藥，具有清熱解毒、祛風化痰和活血止痛功效[2]，而民間亦有以全草、莖及葉入藥的習俗[3-4]，含有兒茶素、原花青素B1和山柰酚-3-O-蕓香糖苷等多種黃酮類成分[5-8]，有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等特性[9-10]。三葉青是多年生藤本陰生植物，在完全日照下生長不良或者不能生長，適宜生長在遮光度為50%～90%的蔭蔽環境中[11]。研究顯示，光照強度影響三葉青蒸騰作用、氣孔導度和光合作用[12]，>50%自然全光照時，三葉青光合作用和生長受到抑制[13]，約30%自然全光照時，三葉青塊莖產量及其總黃酮含量達到最高[14]。提示光照條件是調控三葉青植株及塊根生長發育、黃酮類化合物形成與積累的重要因素。

1 材料與方法

1.1 材料

UV1800型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；SPAD-502型葉綠素計(日本柯尼卡美能達感應公司)。

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110774-201113)；甲醇(德國Merck 公司，色譜純)；水為超純水；氫氧化鈉、亞硝酸鈉和硝酸鋁為分析純。

課題組篩選的優良種質資源三葉青“閩選1號”扦插種苗，由福建中醫藥大學藥用植物實驗室范世明正高級實驗師鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤T.hemsleyanumDiels et Gilg的種苗。

1.2 試驗設計

2017年1月上旬，在福建中醫藥大學時珍園(藥用植物園)大棚內開展試驗，選取生長一致的三葉青“閩選1號”扦插苗移植于控根容器中(直徑50 cm，高30 cm)，土壤均為沙壤土，用黑色遮陽網遮陰生長適應2個月。

本研究設置不同光照強度3個水平，分別為自然光照的5%～10%(A處理)、20%～30%(B處理)、30%～45%(C處理)，約每隔45 d(共8次，用①～⑧表示)進行隨機取樣，分別測定各樣品葉、藤莖及根的質量。

1.3 測定指標和方法

1.3.1葉綠素含量的測定 采用SPAD-502型葉綠素計測定葉綠素相對含量。

1.3.2葉、藤莖和根總黃酮含量的測定 以蘆丁為對照品測定供試樣品總黃酮含量[15-17]，精密稱取蘆丁44.80 mg于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容得對照品溶液。分別吸取對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 置25 mL量瓶中，甲醇定容至5 mL，加 15% 亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，靜置6 min，加10% 硝酸鋁溶液1 mL 混勻，靜置6 min，加10% 氫氧化鈉溶液10 mL，混勻，甲醇稀釋至刻度，靜置15 min。以不加蘆丁的樣品作空白，檢測波長500 nm，得回歸方程：Y=0.013X-0.015 2(r=0.999 3)。精密稱取供試品粉末2.00 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取2次，每次30 min，然后進行反應，500 nm 波長測定樣品黃酮含量。

1.4 數據處理

數據處理采用Excel 2007和SPSS 20.0 軟件。

2 結果

2.1 不同光照強度對三葉青生長發育的影響

三葉青植株形態隨著光照強度增加發生適應變化。如圖1所示，不同遮陰處理360 d后，植株外部形態特征差異較大，A處理植株藤莖較長，葉生長較為茂盛，深綠色，根系較少；B處理藤莖生長一般，葉淺綠色，根系生長旺盛，有較多塊根；C處理藤莖生長緩慢，葉較小、淺黃色，根系生長旺盛，須根長而多，偶見小塊根。

注：A.自然光照5%～10%的三葉青藤莖和葉；B.自然光照20%～30%的三葉青藤莖和葉；C.自然光照30%～45%的三葉青藤莖和葉；D.自然光照5%～10%的三葉青根系；E.自然光照20%～30%的三葉青根系；F.自然光照30%～45%的三葉青根系；箭頭標注三葉青塊根。圖1 不同光照強度下三葉青植株形態

從表1可知，三葉青植株的生物量都呈現上升的趨勢，不同光照強度處理對三葉青生物量的影響較大。在①～⑦時期，莖葉(地上部)干質量：A>B>C，在⑤～⑧時期，C處理三葉青葉和藤莖生物量都明顯比A和B處理的少(P<0.05)；在⑧時期C處理的葉生物量都明顯比B處理少(P<0.05)，說明光照強度太高不利于葉子的生長。在①～⑦時期，根(地下部)干質量C>B>A；在④～⑧時期C處理的根生物量明顯比A處理多(P<0.05)，B處理也比A處理也有明顯增多；而到了⑧時期，根干質量B處理明顯大于A和C處理(P<0.05)，說明適宜的光照強度更有利于根系的生長。

表1 不同光照強度和時間下三葉青生物量 g

2.2 不同光照強度對三葉青葉綠素含量的影響

從圖2可知，不同光照強度對三葉青葉片葉綠素含量影響存在差異，各生長期葉綠素均表現出A>B>C趨勢。說明隨著光照強度的增加，三葉青葉片的葉綠素含量逐漸下降，這可能導致其光合作用能力下降，是造成其藤莖生物量下降的原因。

注：不同小寫字母表示各處理樣品中葉綠素含量差異有統計學意義(P<0.05)。圖2 不同光照強度下三葉青葉綠素含量

2.3 不同光照強度對三葉青葉、藤莖及根總黃酮含量的影響

黃酮類成分是三葉青主要次生代謝產物，也是其主要藥效成分。如圖3～5所示，①～⑧時期，A、B、C處理中三葉青葉總黃酮含量都有不同程度的增加，且均為C>B>A；雖然在①～⑧時期，三葉青藤莖中的總黃酮含量變化不穩定，但不同時期中均為C>B>A；在①～⑤時期，A、B、C處理中三葉青根中總黃酮含量呈上升的趨勢；在⑥～⑧時期，先下降后上升；但在①～⑧時期，三葉青根總黃酮含量均為C>B>A。說明隨著光照強度的增加，三葉青各部位總黃酮均表現出上升的趨勢。

圖3 不同光照強度下三葉青葉總黃酮質量分數

圖4 不同光照強度下三葉青藤莖總黃酮質量分數

圖5 不同光照強度下三葉青根總黃酮質量分數

3 討論

3.1 不同光照強度對三葉青生長發育的影響

植物通過光合作用合成碳水化合物等主要能量產物，在不同的光強下，植物的葉綠素含量、光合特性發生相應的變化，其生物量及生長發育會受到不同程度的影響[18]。研究顯示，遮陰處理有利于三七等喜陰藥用植物的生長發育，與全日照相比，遮陰條件下其生長速度加快、生物量明顯增長、葉面積增大、葉色深綠、葉片的葉綠素含量增加、葉片凈光合速率升高等[19]。適宜的光照條件有利于三葉青植株及塊根生長發育，如23 μmol·m-2·s-1的光強有利于三葉青腋芽外植體的萌發[20]。

本研究表明，三葉青植株的總生物量都隨著時間的推移呈現增長的趨勢，地上部分的A處理生物量明顯優于B和C處理，這可能是三葉青喜涼爽氣候的習性有關，A處理遮光密度大，比較陰涼，有利于其莖葉的生長，所以A處理的三葉青地上部分生物量較大；地下部分卻是B與C處理的生物量明顯優于A處理，這可能是根系的生長與光照強度有關，C處理光照強度最強，溫度較高，土壤含水量相對較低，植株響應光照過強而表現出的適應性生長，所以根系生長較旺；而B處理地下塊根明顯優于A與C處理，這可能是由于適度的光照條件有利于三葉青地下塊根的形成與膨大。各時期A處理三葉青的葉片葉綠素含量高于B與C處理，這與圖1中其葉片的顏色特征相吻合，而A處理地上部生物量較高，說明較低的光照強度條件更有利于三葉青進行光合作用和莖葉生長；①～⑥時期葉綠素含量呈現明顯的增長趨勢，⑦時期明顯降低，在⑧時期又明顯上升，究其原因，⑥～⑦處于冬季時期，可能是由于氣溫較低影響葉綠素的形成，植物進入休眠狀態，⑦時期以后，氣候溫暖、陽光充足，故而后期的葉綠素含量又急劇上升。

3.2 不同光照強度對三葉青總黃酮含量的影響

植物化學成分的形成和積累受光照強度的調控，光強不足可限制植物的光合作用，減少碳源產物的合成，致使其生長受阻，而光強過強則會損傷光合器官[21-22]。對藥用植物而言，光照強度影響其黃酮類等次生代謝產物的合成。銀杏幼苗葉和三葉青塊根總黃酮含量隨光照強度變化而改變，在透光度約為30%時，其總黃酮含量最高，而強光或過度遮陰，總黃酮含量均下降，認為適度光照強度有利于黃酮類化合物的的合成與積累[23]。

本研究表明，在不同生長時期中，三葉青的總黃酮含量均表現為葉>藤莖>根，而葉片作為植物進行光合作用的場所，隨著光照強度的增強，三葉青植株可能為了響應這種環境條件的改變，葉片中的光合產物轉化為黃酮類化合物，從而適應光照強度的升高。對于陰生植物的三葉青而言，其葉片所接受光照強度范圍的篩選是最關鍵的栽培調控措施。從⑤～⑧時期，三葉青葉總黃酮含量隨著光強的增加而上升，B或C處理與A處理差異有統計學意義，而B處理和C處理之間差異無統計學意義，這表明三葉青葉中黃酮類化合物的合成需要較高的光照強度；①～⑧時期，相對于A或B處理，C處理可以顯著性提高三葉青根總黃酮含量，說明較高的光照強度可以促進黃酮化合物合成及轉運。

3.3 三葉青適宜光照強度的栽培技術

藥用植物栽培技術的確立不僅要考察藥用部位的生物產量，還要考量其藥效化學成分含量，以實現藥材生產的產量大、品質優的目的。從三葉青總黃酮測定結果可以看出，在生長后期，葉總黃酮含量較高，而藤莖和根總黃酮含量較低，如⑧時期，葉總黃酮含量為藤莖的5.01～6.67倍，為根的4.43～6.08倍，B和C處理可以顯著提高其總黃酮含量，而B、C處理之間差異無統計學意義，說明隨著光照強度的增加可以提高三葉青總黃酮的含量，但存在一個臨界值；從三葉青藥用部位生物量來看，隨著光照強度的增加，其葉和藤莖生物量下降，根系生物量增加，促進塊根的形成與發育。如圖1所示，B處理中三葉青葉顏色保持綠色，根系生長旺盛，有較多塊根；而C處理葉淺黃色，根系生長旺盛，須根長而多，有少量小塊根。這說明適當增加光照強度可以促進三葉青根系生長與塊根的形成，但光照強度過強可能損傷葉光合系統而影響植物生長。因此，綜合三葉青活性成分含量和生物量，B處理可以促進三葉青黃酮類成分的合成與累積、促進塊根的形成與膨大。

適度增加光照強度有利于三葉青塊根的發育及總黃酮的累積，透光度20%～30%的條件較適合三葉青的栽培。