UPLC-MS/MS同時測定使君子藥材中9個成分的含量△

溫秀萍，彭琴，2，鄒福賢，2，張廣玲，于虹敏，許文，2*，林羽，2，徐偉，2*，余波

1.福建中醫藥大學 藥學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學 生物醫藥研發中心，福建 福州 350122

使君子是使君子科使君子屬植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥成熟果實，性甘溫，歸胃、脾經，用于殺蟲消積、健脾胃、除虛熱、殺臟蟲[1]?，F代藥理研究表明，使君子具有抗菌[2]、抗病毒[3]、殺蟲驅蟲[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗高脂血癥[7]、抗糖尿病[8]、抗癌[9]等多種藥理作用。使君子化學成分研究表明，其主要含有有機酸類、鞣質類及揮發性化合物等[10-13]，這些成分是其多種藥理作用的物質基礎。

目前關于使君子質量控制的相關研究報道較少?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版中使君子以胡蘆巴堿為含量測定的指標[1]；朱華等[14]以使君子中使君子酸鉀含量為指標，比較廣東、廣西及四川省3個不同產地使君子的質量；陳芝華等[15]采用高效液相色譜法(HPLC)測定了不同產地使君子中葫蘆巴堿的含量；李改仙等[16]測定了使君子葉和枝中的總黃酮含量；姜舜堯等[17]采用高效離子交換色譜法分析使君子藥材中胡蘆巴堿成分。但是鑒于使君子具有多方面的藥理活性[2-9]，只檢測單一成分存在一定的片面性，難以反映出藥材的整體質量。查閱國內外文獻，目前尚未見對使君子多成分測定的文獻報道。因此，建立多成分綜合評價的方法對使君子質量控制水平的提升有重要的意義。

隨著現代分析技術方法的快速發展，超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS)越來越多地應用于中藥或復方的分析[18-21]，因質譜具有良好的專屬性和靈敏度，有利于中藥材和中藥復方的多成分質量控制，常應用于中藥復雜體系化學成分的定量或定性研究。

因此，本研究通過建立UPLC-MS/MS，同時測定使君子中9個化學成分(葫蘆巴堿、香草酸、阿魏酸、丁香酸、兒茶素、鞣花酸、蘋果酸、沒食子酸和沒食子酸甲酯)，并結合化學計量學篩選使君子的潛在質控標志物，為使君子質量控制提供參考。

1 材料

1.1 藥材

使君子34批藥材分別于2018年9月—2019年3月于廣西(批號：GX1～GX8)、四川(批號：SC1～SC12)、廣東(批號：GD1～GD4)、福建(批號：FJ1～FJ10)地區收集，經福建中醫藥大學藥學院高級實驗師范世明鑒定為使君子科植物使君子QuisqualisindicaL.的干燥果實，所有樣品存放于福建中醫藥大學中藥資源標本室。

1.2 試劑

對照品葫蘆巴堿(批號：MUST-18050501)、阿魏酸(批號：MUST-19010106)、丁香酸(批號：MUST-18083107)、沒食子酸(批號：MUST-18032401)、沒食子酸甲酯(批號：MUST-19012503)、兒茶素(批號：MUST-18123009)、蘋果酸(批號：MUST-19021503)、鞣花酸(批號：MUST-18112002)、香草酸(批號：MUST-18051106)均購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均大于98%；甲醇、乙腈為色譜純(德國Merck公司)；Milli-Q超純水(美國Millipore公司)；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

ACQUITY UPLC I-Class型超高效液相色譜儀串聯Xevo-TQS型三重四級桿質譜(美國Waters公司)；CPA225D型十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)；KQ-500DE型臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)。

2 方法與結果

2.1 UPLC-MS/MS分析條件

2.1.1色譜條件 色譜柱為Welch Xtimate C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脫(0～2.0 min，98%A；2.0～4.0 min，98%～60%A；4.0～6.0 min，60%～40%A；6.0～6.5 min，40%～98%A；6.5～8.0 min，98%A)；流速：0.20 mL·min-1；柱溫：45 ℃；進樣量：2 μL。

2.1.2質譜條件 正、負切換電噴霧離子源(ESI)，定性離子掃描模式(MS Scan)，質量數范圍為m/z50～1000，子離子掃描模式(Daughter Scan)，定量采用質譜多反應監測模式(MRM)；毛細管電壓：負離子模式為-2.5 kV，正離子模式為3.5 kV；脫溶劑流速：氮氣800 L·h-1；脫溶劑溫度：500 ℃；錐孔氣流速：氮氣150 L·h-1；離子源溫度：150 ℃；碰撞氣體：氬氣。其他質譜參數見表1。

表1 使君子中9個成分的質譜測定條件

2.2 溶液的配制

2.2.1對照品溶液制備 分別精密稱取胡蘆巴堿、蘋果酸、沒食子酸、兒茶素、沒食子酸甲酯、香草酸、丁香酸、鞣花酸、阿魏酸對照品適量，加入色譜甲醇制備成質量濃度分別為1.458、0.638、0.490、0.047、0.072、1.017、0.680、0.512、0.057 mg·mL-1的各單一對照品母液。精密量取適量單一對照品母液置于5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，得到9個對照品質量濃度分別為204.120、63.800、19.600、9.400、7.200、20.340、13.600、51.200、2.052 μg·mL-1的混合對照品儲備液。取混合對照品儲備液逐級稀釋，即得不同質量濃度的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 取使君子粉末(過二號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入50%甲醇水溶液20 mL，密塞，稱定質量。超聲處理(功率：250 W，頻率：50 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇水溶液補足減失的質量，搖勻，0.22 μm濾膜濾過。取續濾液按1∶19加入50%甲醇水溶液稀釋，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1專屬性考察 取供試品溶液、混合對照品溶液適量，按2.1項下色譜和質譜條件進樣分析，得到使君子正、負離子模式下的總離子流圖，見圖1。在MassLynx 4.1工作站中對正、負總離子流進行分子離子峰的識別，根據母離子、子離子質譜信息，結合使君子已有化學成分研究[10-13]，共鑒定9個成分，并經對照品比對，其tR、母離子、子離子質譜信息與對照品信息均一致。9個成分分離良好，空白無干擾，符合分析要求。

注：A.空白溶液；B.對照品溶液；C.使君子樣品溶液(批號：FJ8)；1.胡蘆巴堿；2.蘋果酸；3.丁香酸；4.兒茶素；5.沒食子酸甲酯；6.香草酸；7.丁香酸；8.鞣花酸；9.阿魏酸。圖1 空白溶液、對照品溶液和使君子樣品的MRM離子流色譜圖

2.3.2線性關系及檢測下限、定量下限考察 吸取2.2.1項下對照品溶液適量，用50%甲醇水溶液逐級稀釋，配制系列質量濃度梯度的對照品混合溶液，按2.1項下條件進樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(Y)，待測組分質量濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，繪制標準曲線，得回歸方程和相關系數(r)。以信噪比(S/N)為3計算9個待測組分的檢測下限，以S/N為10計算9個待測組分定量下限，結果見表2。

表2 9個化合物回歸方程、線性范圍、r、檢測下限及定量下限

2.3.3精密度試驗 取同一份混合對照品溶液，在2.1項色譜、質譜條件下測定，記錄峰面積并計算RSD。1 d內連續進樣6次測定日內精密度RSD為1.2%～2.7%；每天進樣3次，連續測定3 d，測定日間精密度RSD為1.3%～3.3%。實驗結果表明儀器精密度良好。

2.3.4穩定性試驗 按2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、6、10、12、24 h按2.1項下色譜、質譜條件進樣測定，根據標準曲線計算各個時間點9個組分質量濃度，計算RSD為1.3%～3.2%。實驗結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.5重復性試驗 精密稱取同一批次(批號：FJ8)使君子藥材樣品6份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜、質譜條件進樣測定，計算9個化合物質量分數的RSD為1.1%～2.4%，結果表明，實驗方法重復性良好。

2.3.6加樣回收率試驗 精密稱取2.3.4項下已測得含量的使君子粉末6份，約0.25 g，分別近似1∶1加入各對照品，按2.2.2項方法制備供試品溶液，按2.1項下條件進樣測定含量，計算回收率，9個成分的平均回收率為95.36%～99.47%，RSD為2.52%～3.44%，表明回收率良好。

2.4 樣品含量測定

分別精密稱取不同產地的使君子樣品粉末，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜及質譜條件進樣測定峰面積，將各組分峰面積代入回歸方程計算得到樣品中9個組分的含量結果，見表3。

表3 各批次使君子樣品中9個成分的含量(n=3) mg·g-1

續表3

2.5 數據分析

將34批次使君子樣品中9個成分的含量數據導入到OmicShare Tools熱圖聚類分析工具，設置歸一化法，得到熱圖聚類分析圖，見圖2?？v向的聚類反映不同批次樣品之間的關系，熱圖顏色的深淺反映不同批次樣品中相應成分的含量。進一步運用GraphPad 8.01數據處理軟件對4個產地使君子樣品含量進行箱型圖統計分析，見圖3。采用SPSS 19對34批次使君子的含量進行主成分(基于最大方差法)的特征值貢獻率分析，結果見表4～5。

注：1.胡蘆巴堿；2.蘋果酸；3.丁香酸；4.兒茶素；5.沒食子酸甲酯；6.香草酸；7.丁香酸；8.鞣花酸；9.阿魏酸。圖2 不同產地使君子樣品中9個成分的熱圖聚類分析

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。圖3 不同產地使君子中9個成分含量箱型圖

表4 34批次使君子樣品的主成分特征值貢獻率

表5 使君子中9個成分對主成分的貢獻值

3 討論

3.1 色譜、質譜條件的選擇

在色譜柱的選擇上，比較了不同色譜柱：Waters HSS T3 C18(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)、Waters CORTECS C18(100 mm × 2.1 mm，1.6 μm)、Phenomenex kintecx(100 mm× 2.1 mm，1.7 μm)及Welch Xtimate C18(100 mm × 2.1 mm，1.8 μm)，結果表明，Welch Xtimate C18色譜柱在色譜峰的保留和峰形上優于其他色譜柱，并且達到基線分離的分析時間縮短，效率提高，因此選擇該色譜柱。流動相系統的選擇中，考察了4種流動相系統：乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液，實驗結果證明，流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時，使君子樣品中9個成分峰形優于其他系統，因此選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。質譜條件選擇中，本實驗采用MRM正、負離子切換模式同時定量9個待測成分，優選最佳的碰撞能量和錐孔電壓，葫蘆巴堿、香草酸、阿魏酸、丁香酸、鞣花酸在正離子模式下靈敏度高于負離子模式，而沒食子酸、沒食子酸甲酯、兒茶素及蘋果酸則是在負離子模式下靈敏度較高。

3.2 樣品含量測定結果分析

使君子藥理研究表明其具有抗菌[2]、抗病毒[3]、殺蟲驅蟲[4]、抗氧化[5]、抗炎[6]、抗高脂血癥[7]、抗糖尿病[8]、抗癌[9]等多種藥理作用。從本次測定的指標來看，生物堿類成分葫蘆巴堿是使君子的主要成分之一，其具有驅蟲作用[12]；使君子中酚酸類成分沒食子酸、鞣花酸、香草酸、蘋果酸、兒茶素、丁香酸、阿魏酸、沒食子酸甲酯等成分具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、降血糖、保肝[22-29]等作用，9個測定的成分可能均是使君子發揮藥效的物質基礎。對34批次不同產地使君子藥材9個成分含量測定的結果表明，葫蘆巴堿的質量分數最高，達到2.541～3.938 mg·g-1，其次是鞣花酸0.167～1.221 mg·g-1，其余成分含量較低，除蘋果酸外，其他有機酸質量分數均低于0.5 mg·g-1。聚類分析結果表明，不同產地使君子表現為不同聚類方式。熱圖響應結果表明，胡蘆巴堿、蘋果酸、兒茶素在福建產使君子樣品中的含量高于其他產區樣品。從9個成分含量的箱型圖可知，使君子指標性成分胡蘆巴堿含量的中位值在福建和廣西地區樣品中高于四川和廣東地區樣品；福建產使君子樣品中蘋果酸、兒茶素含量的中位值高于其他3省；廣東和福建產使君子樣品中沒食子酸和香草酸含量的中位值高于廣西與四川樣品；廣東產使君子樣品中鞣花酸含量的中位值顯著高于福建、四川和廣西樣品；其他成分含量相對較低且不同產地之間差異不明顯。主成分的累積貢獻率結果表明，主成分1和2的貢獻率最高，累積貢獻率>50%，并且主成分1對應的最大貢獻成分為胡蘆巴堿(0.748)和蘋果酸(0.714)，而主成分2的最大貢獻成分為鞣花酸(0.911)。綜上，通過UPLC-MS/MS測定結合9個成分的含量，發現胡蘆巴堿、鞣花酸和蘋果酸的含量相對較高，并且對聚類熱圖及主成分的貢獻較大，同時箱型圖的結果可知，3個成分在不同產地間具有明顯的差異性，因此，胡蘆巴堿、鞣花酸和蘋果酸對使君子的質量評價可能具有重要意義。且這3個成分具有殺蟲[4]、抗慢性病[26]、抗菌[29]、抗氧化[30]等作用，建議將其作為使君子的質控標志物。

本草考證和文獻記載查證表明，使君子藥用品種使用沒有混亂，與現今《中國藥典》收載的使君子一致，主產地為廣東、廣西、福建、四川等地，道地產區為四川眉州、合川和福建邵武[31-32]。本研究測定了福建、四川、廣西、廣東4個產區使君子藥材中9個成分的含量，不同產區藥材雖然基原一致，但是成分間含量存有差異，化學聚類存在明顯區分。本研究建立的UPLC-MS/MS快速、靈敏度高，可以實現使君子藥材多成分同時測定，并且篩選出胡蘆巴堿、鞣花酸和蘋果酸3個成分可作為使君子的質控標志物，為使君子整體質量控制和評價提供參考。