長白山地區藥用植物龍膽DNA條形碼鑒定△

張強，張維維，丁勇，王佳雪，方春秋，齊偉辰*

1.長春中醫藥大學 藥學院，吉林 長春 130117；2.吉林省長白山中藥資源工程研究中心，吉林 長春 130117

龍膽GentianascabraBunge為龍膽科多年生草本植物，為我國常用藥用植物，其根及根莖入藥，有極其重要的經濟價值和藥用價值。龍膽主產東北地區，春、秋二季均可采收，以秋采者質量最佳。龍膽含有多種化學成分且藥理活性顯著，能夠保肝、健胃、抗炎、抗菌、調節免疫力等[1]。《中華人民共和國藥典》2015年版記載中藥龍膽的基原植物包括龍膽、三花龍膽G.trifloraPall.、條葉龍膽G.manshuricaKitag.或者堅龍膽G.rigescensFranch.，前3種習稱為“龍膽”，后一種習稱為“堅龍膽”[2]。龍膽是近200種中成藥的重要原料[3]，如龍膽瀉肝湯等[4]。

DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的、相對較短的序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術。在藥用植物的物種鑒定領域，DNA條形碼鑒定技術最實際的用途即是對未知樣品進行準確鑒定，采用標準化實驗流程獲得未知樣品DNA條形碼序列，應用Blast分析、序列比對、建樹法、距離法等標準化鑒定流程確保未知樣品鑒定的準確性[5-6]。龍膽植物分類復雜，由于不同類群的特征性狀交叉重疊，各類型界限模糊不清，給其鑒定帶來非常大的困難。目前國內外對龍膽質量、藥用價值、藥理作用、生物分子遺傳多樣性等不同領域均有研究。本實驗采用DNA條形碼技術，對長白山不同地區龍膽植物和藥材進行鑒定研究，以期為規范龍膽藥材市場、準確鑒別藥材來源和資源評價提供參考。

1 材料

1.1 藥材

龍膽GentianascabraBunge植株采集于吉林省長白山10個不同地區，共31份，由長春中醫藥大學藥學院齊偉辰副教授鑒定，來源見表1。GenBank下載同屬植物ITS2序列10份，見表2。

表1 龍膽樣本來源

表2 龍膽屬植物ITS2序列

1.2 試劑

無水乙醇、三氯甲烷、氯化鈉、鹽酸(北京化工廠)；異丙醇、氫氧化鈉(天津市興復科技發展有限公司)；RNase A溶液(10 mg·mL-1，康為世紀生物科技股份有限公司)；溴化十六烷基三甲胺(CTAB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙二鈉鹽(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)；溴化乙錠(EB)溶液(上海捷瑞生物工程有限公司)；石蠟油[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3 儀器

DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；WD-2105A型微型離心機、DYY-10C型電泳儀、WD-9403F型紫外儀(北京市六一儀器廠)；ETC811型基因擴增儀(蘇州東聯興業科學儀器有限公司)；JX-FSTPRP型全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信實業發展有限公司)。

2 方法

2.1 DNA提取

龍膽基因組DNA提取使用冷凍保存的葉片和根，采用改良的CTAB法提取DNA[7]。使用瓊脂糖凝膠電泳法及紫外分光光度計檢測DNA純度和濃度，提取DNA的A260 nm/A280 nm值為1.8～1.9(A表示吸光度)，質量濃度為4.85～6.50 μg·μL-1。

2.2 PCR擴增及測序

正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。聚合酶鏈式反應(PCR)體系為20 μL，含PremixTaq10 μL、ddH2O 8 μL、FP(10 μmol·L-1)0.5 μL、RP(10 μmol·L-1)0.5 μL、DNA模板(100 ng·L-1)1 μL。PCR擴增反應步驟為95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，55 ℃，15 s，72 ℃，1 min，40個循環；72 ℃，5 min；40 ℃保存[5]。PCR擴增產物經純化后進行雙向測序，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.3 數據處理

測序結果經Chromas校正，并將序列運用SeqMan軟件進行拼接，根據峰圖基序列對比，去除質量差的部分，截取了250 bp長度的序列，并將截取的序列在GenBank核苷酸數據庫中Blast檢索并下載相似度高的龍膽、堅龍膽、筆龍膽、三花龍膽、高山龍膽、條葉龍膽序列。所有候選序列經MEGA 7.0軟件自動比對分析堿基之間的差異，計算Kimura 2-parameter (K2P)遺傳距離及建立鄰接(NJ)聚類進化樹分析。聚類分析檢測選擇Bootstrap方法，重復1000次，鑒定各樣本。使Kimura 2-參數型作為氨基酸替代模型。

3 結果與分析

3.1 基于ITS2堿基序列的物種鑒定分析

共10個地區31個龍膽葉片及藥材樣本瓊脂糖凝膠電泳的DNA提取率為100%，ITS2序列擴增成功率為100%，測序成功率為100%，由測序后峰圖分析得知，各序列堿基相對分子質量>20，經Blast比對確定31個樣本堿基序列為所需鑒定品種。

3.2 種內種間變異分析

龍膽屬植物41個樣本，經SeqMan處理后，ITS2序列長度為205～210 bp。應用MEGA 7.0軟件做序列對比，41個樣品中有36個堿基變異位點。其中采集的龍膽樣品與GenBank下載的筆龍膽有21個變異位點、與三花龍膽有6個變異位點、與堅龍膽有21個變異位點、與高山龍膽共有19個變異位點、與龍膽均無變異位點。10個不同地區的龍膽之間也沒有堿基變異位點，見表3。

表3 基于ITS2堿基序列各龍膽屬樣本間的堿基變異位點

10個不同地區的龍膽及GenBank下載的龍膽種內遺傳距離為0，區分不明顯。筆龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.09和0.10，三花龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.03、0.09和0.10，條葉龍膽與除龍膽外的其他同屬龍膽的種間遺傳距離為0.09、0.10及0.03，堅龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.10、0.12和0.09，高山龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.07和0.11，區分明顯，見表4。

表4 基于ITS2堿基序列各龍膽屬樣本間的K2P遺傳距離

3.3 NJ樹聚類分析

基于41個樣本的ITS2序列建立NJ聚類進化樹，見圖1，可知采集的31個樣本和GenBank下載的龍膽及條葉龍膽聚為1支，其他龍膽屬各種植物都自聚為1支，其中筆龍膽為1支，三花龍膽為1支，高山龍膽為1支，堅龍膽為1支。可以明顯地區分出龍膽屬多數不同種植物，雖然具有一定程度上的親緣關系，但仍然存在差別；同時結合變異位點及K2P遺傳距離可清楚發現，條葉龍膽和龍膽應用ITS2堿基序列區分種間差異較小；吉林省長白山10個不同地區的龍膽種內幾乎無差異，結合基于ITS2堿基序列變異位點、K2P遺傳距離比較、NJ聚類進化樹顯示得出，吉林省長白山藥用植物龍膽為同一種龍膽，無任何差異，鑒別成功率100%。

圖1 基于各樣本ITS2堿基序列建立的龍膽屬植物NJ聚類樹

4 討論

吉林省長白山10個不同地區龍膽葉片和藥材的ITS2序列沒有顯示出明顯的地區差異性，這與有效片段長度、取樣地的覆蓋度、道地藥材的性質有關。道地藥材從生物學內涵講是生物學上的居群，其產生除了與藥材特定的生態環境和特殊的采收加工技術有關外，還與該道地藥材產區內這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關。所以道地藥材的一個重要特征就是遺傳特征，應將其看作一個具有共同基因庫、由交配和親緣關系聯系起來的同一物種的個體群。因此，應用DNA分子遺傳標記鑒別方法，結合現代分子生物學手段，通過對遺傳信息的分析，能夠作為確定藥材道地性的手段之一[8-10]。本研究的樣本龍膽與從GenBank上下載龍膽的ITS2序列都能較好地區分，種內變異情況幾乎不可見。由此可見，運用ITS2序列對龍膽進行鑒別是有效可行且成功率較高的一種分子鑒定方法；本研究也為DNA分子鑒別應用在龍膽科其他屬或者其他中藥材的鑒別提供了參考。

龍膽屬藥用植物較多，有龍膽、三花龍膽、條葉龍膽、高山龍膽、堅龍膽等。本研究主要是對吉林省長白山地區藥用植物龍膽進行鑒別，提取了長白山10個不同地區的龍膽作對比，結果顯示，長白山各地區龍膽序列無差異，鑒定為龍膽；同時比較了龍膽與三花龍膽、條葉龍膽、高山龍膽、堅龍膽等其他各龍膽屬植物間的種間差異，龍膽屬植物皆有明顯區別。理想的DNA條形碼要有足夠的種間變異和較小的種內差異。DNA分子條形碼鑒別方法可以用于龍膽屬種間及種內鑒別。從分子生物學角度即基因層面進行研究，比較DNA堿基序列上的差異，不受樣品形態限制，減少了人為主觀因素影響，使鑒定結果更加準確，從而實現中藥鑒定標準化、自動化。