基于4種序列的遼產蒼術屬植物DNA條形碼鑒定△

尹海波，鄧聰，王娜，任雪，陳吉祥

遼寧中醫藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600

菊科蒼術屬(AtractylodesDC.)植物為多年生草本，我國境內有5種，遼寧地區有4種，分別為關蒼術A.japonicaKoidz.ex Kitam、朝鮮蒼術A.coreana(Nakai)Kitam、茅蒼術A.lancea(Thunb.)DC.[1](引種栽培)、北蒼術A.chinensis(Bunge)Koidz.[2]。蒼術首載于《本草經集注》[3]，名為“赤術”?！吨腥A人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2015年版以茅蒼術和北蒼術干燥根莖為蒼術的正品基原，主治濕阻中焦、風濕痹痛等癥[4]。

DNA條形碼鑒定技術是一種在分子水平上具有很高可靠性的物種鑒定方法[5-6]?！吨袊幍洹?015年版以內轉錄間隔區2(ITS2)作為DNA條形碼鑒定技術的主要序列片段，以psbA-trnH序列片段為輔鑒定物種[7]。matK基因是保證葉綠體功能正常運行的重要基因之一[8]，廣泛應用于枸杞、姜科植物、燈盞花等物種鑒定[9-11]。rbcL基因在光合作用和光呼吸中起關鍵作用[12]，應用于浙貝母、陽春砂、鳶尾屬植物等物種的鑒別[13-15]。因此，本研究使用這4種序列片段對遼寧省蒼術屬植物進行研究，探究適合蒼術屬分類的基因序列，并探究種內與種間、野生品與栽培品之間的差異，為遼寧省蒼術屬植物規范化栽培種植提供參考。

1 材料

1.1 藥材

通過野外收集及栽培基地走訪，共收集遼寧地區蒼術屬植物4種，共43份樣品，其中朝鮮蒼術Atractylodescoreana(Nakai)Kitam 23份、茅蒼術A.lancea(Thunb.)DC 3份、關蒼術A.japonicaKoidz. ex Kitam 6份、北蒼術A.chinensis(DC.) Koidz 11份，所有樣品經遼寧中醫藥大學中藥資源教研室尹海波教授鑒定，樣品存放于遼寧省中藥原料質量檢測技術服務中心。樣品信息見表1。

表1 遼寧蒼術屬植物樣品信息

續表1

1.2 試劑

DP320新型植物基因組提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]；2×EsTaqMasterMix (Dye)(北京康為世紀生物科技有限公司)；引物(北京六合華大基因股份有限公司)；瓊脂糖及溴化乙錠(上海Sangon公司)；Trans 2k DNA Marker(大連寶生物股份有限公司)；無水乙醇等試劑(天津科密歐有限公司)。

1.3 儀器

PT-35SL型微量電子天平[華志(福建)電子科技有限公司]；TGL-16M型高速離心機(湖南湘儀實驗儀器開發有限公司)；HH-ZK型數控恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限公司)；G1000改進型基因聚合酶鏈式反應(PCR)儀(杭州博日科技有限公司)；4100型凝膠成像處理系統(上海天能科技有限公司)；渦旋混勻器(德國IKA公司)；ABI3730XL型測序儀(美國Applied Biosystems公司)；移液槍(美國賽默飛世爾公司)；BCD-451WDEMU1型冰箱(青島海爾股份有限公司)。

2 方法

2.1 總DNA提取

選取干燥葉片，使用75%乙醇擦拭表面，干燥后放入無菌研缽，加入適量液氮研磨成細粉，稱取20 mg粉末，用試劑盒提取蒼術總DNA，操作步驟及注意事項均遵照試劑盒說明書。

2.2 PCR擴增體系及條件

PCR擴增體系為50 μL，包括2×EsTaqMasterMix (Dye) 25 μL，正反雙向引物各2 μL，DNA模板3 μL，加入ddH2O(18 μL)補充至50 μL，充分混勻后備用。PCR擴增結束后，產物經過純化采用雙向測序。引物名稱、序列及擴增條件見表2。

表2 引物名稱、序列及擴增條件

2.3 數據處理

將測序后的正反向序列使用DNAMAN 8.0軟件拼接，使用MEGA 6.0軟件進行序列比對，除去低質量區及引物區獲得目標序列，將比對好的序列使用鄰接法構建系統進化樹。

3 結果與分析

蒼術屬植物共43個樣品4種序列通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA提取成功率、擴增成功率均為100%，4種序列雙向測序成功率為100%。

3.1 系統發育樹聚類分析

基于ITS2、psbA-trnH、matK、rbcL 4種序列構建系統聚類樹，見圖1。4種序列系統聚類樹聚類結果表明，僅ITS2序列將43個樣本的4種蒼術屬植物各自分為一支，分類清晰；而psbA-trnH、matK、rbcL 3種序列聚類較混亂，種之間不能各自分為一支，因此不能作為4種蒼術屬植物DNA條形碼鑒定的依據。

注：A.ITS2序列；B.psbA-trnH序列；C.matK序列；D.rbcL序列。圖1 蒼術屬植物4種序列系統聚類樹

3.2 ITS2二級結構分析

將比對后得到的ITS2序列通過Internal Transcibed Spacer 2 Ribosomal RNA Database(http：//its2.bioapps. biozentrum.uni-wuerzburg.de/#opennewwindow)網站預測二級結構，見圖2。圖中為4種蒼術屬植物ITS2序列的二級結構，由1個主環和4個螺旋組成，結構模型均為綠色，顯示輸入序列為BLAST標識模型，綠色圓點表示同源序列的結構和位置。從圖2中可以看出，4種蒼術屬植物ITS2序列模型相似，但是莖環數目和位置各不相同，莖環大小也有一定差異。

圖2 蒼術ITS2序列二級結構

3.3 種間和種內變異

43個蒼術樣品ITS2序列長度均為229 bp，其中種間變異位點有11個，其中朝鮮蒼術、茅蒼術種內并無差異，關蒼術種內G3樣品34號位存在1個變異位點C→T，G1～G3樣品125號位存在1個變異位點T→A，北蒼術種內B8、B10樣品206號位存在1個變異位點C→T，見表3。基于ITS2序列的蒼術屬植物種間遺傳變異距離(0.012 494～0.044 865)>蒼術屬植物種內遺傳距離(0～0.003 726)，見表4。

表3 基于ITS2序列的蒼術屬植物種間及種內變異位點

表4 基于ITS2序列的蒼術屬植物種間遺傳變異距離

4 討論

蒼術作為大宗藥材，具有悠久的歷史?！哆|寧植物志》[2]中記載遼寧蒼術屬植物有3種，為北蒼術、關蒼術、朝鮮蒼術。而本實驗樣品中的茅蒼術是從江蘇茅山引種至遼寧清原。4種蒼術屬植物的ITS2序列二級結構圖顯示，朝鮮蒼術和北蒼術的非同源結構及位置較少，關蒼術和茅蒼術相似但也有差異，關蒼術與其他3種蒼術不同之處在于多了1個環狀結構。從系統聚類樹可知，朝鮮蒼術和北蒼術為1支，支持率分別為65%和63%；茅蒼術和關蒼術為1支，支持率分別為63%和62%。4種蒼術屬植物聚類清晰，因此ITS2序列可作為遼寧蒼術屬植物DNA條形碼的有效序列。

《遼寧植物志》對于北蒼術和朝鮮蒼術的地理分布記載為“北蒼術生于灌叢間或干山坡”“朝鮮蒼術生于林下、林緣或干山坡”。姜宇珺等[18]研究結果表明，ITS2序列無法區分北蒼術和朝鮮蒼術，原因可能是其選用的北蒼術均為栽培品，栽培蒼術人工干預其生長環境的因素較大，因此導致2種蒼術遺傳分化不明顯。因《遼寧植物志》記載朝鮮蒼術和北蒼術地理分布和生長環境等有一定差異，郭蘭萍等[19]認為，蒼術遺傳分化和地理分布具有一定相關性，因此產生了差異。

Chase等[20]認為，rbcL基因序列的變異水平在種間水平以上，種間及種內的變異很小，可能是rbcL基因序列不能鑒定蒼術屬植物的主要原因。Kress等[21]認為，與種間變異相比，psbA-trnH序列的種內變異相對較低。從系統聚類樹中得知，matK、psbA-trnH對蒼術的物種分離度低，因此不適合鑒定蒼術屬植物。Chen等[22]對7種序列識別物種的成功率進行了比較，發現ITS2>psbA-trnH>matK>rbcL，而本實驗4種系統聚類樹結果也驗證了ITS2序列的識別能力最強。

馬起鳳等[23]根據性狀推測朝鮮蒼術和北蒼術均由南蒼術(河南以南)演變而來，蒼術葉裂這種性狀具有不穩定性，不具備一定的分類學意義。從本實驗結果ITS2序列片段系統聚類樹來看，朝鮮蒼術和北蒼術確實有較近的親緣關系；ITS2序列片段不能將葉裂和葉不裂的蒼術區分開，變異位點顯示葉裂與葉不裂也沒有差異，因此，這2種性狀可能不是由于基因變異造成的。系統聚類樹和變異位點結果表明，蒼術屬野生品與栽培品沒有差異，無法通過DNA條形碼鑒定，可以考慮從化學成分、顯微結構等方面進行鑒定。《中國植物志》中根據蒼術的生態型將北蒼術和茅蒼術合并為1個種，根據本實驗結果，2種蒼術在分子生物學鑒定中存在一定差異，建議將北蒼術列為茅蒼術的亞種，茅蒼術作為原亞種較為合適。