基于Illumina MiSeq高通量測序技術分析不同保質期雞蛋干的微生物群落多樣性

宋思家，黃子彧，林瑩瑩，郭慧媛*

1(中國農業大學 食品科學與營養工程學院，精準營養與食品質量重點實驗室，教育部功能乳品重點實驗室，北京，100083) 2(中國農業大學 食品質量安全北京實驗室，北京，100083)

雞蛋干是中國市面上常見的休閑蛋制品，因其營養豐富、風味獨特而深受消費者喜愛。依據GB 2749—2015《食品安全國家標準 蛋與蛋制品》內容，在保質期內的雞蛋干在感官方面應具有產品正常的色澤、滋味、氣味，無異味，且具有產品正常的形狀、形態、無酸敗、霉變等；在微生物限量方面，其菌落總數應<104CFU/g，大腸菌群應<10 CFU/g[1]。目前在實際生產過程中，雞蛋干的保質期為9個月。雞蛋干的生產原料以全蛋液或蛋清液為主，在加工制作過程中極易受到微生物污染而導致產品腐敗變質[2]。相關調查研究表明，預包裝雞蛋干即便經過高壓蒸汽滅菌后也可能出現脹包、湯汁渾濁、有異味的變質現象，尤其在夏秋高溫季節，雞蛋干發生腐敗變質的概率更高[3]。最近數十年，雞蛋干的市場在不斷擴大，因此對雞蛋干的防腐保鮮開展研究愈顯重要。而明確雞蛋干的優勢致腐微生物，是防腐的首要關鍵。然而目前對于雞蛋干的腐敗微生物群落多樣性的報道十分有限，賀燕等[3]從腐敗雞蛋干中分離鑒定得到2株芽孢桿菌，袁先鈴等[4]在腐敗雞蛋干中檢測到彭氏變形菌和奇異變形菌。因此，開展雞蛋干中腐敗微生物群落多樣性的研究具有重要意義。

對于微生物群落多樣性的研究，長期以來主要是基于《伯杰細菌鑒定手冊》，對微生物菌落進行分離、純化，進而通過形態學觀察和一系列復雜的生理生化實驗進行鑒定。這種傳統方法不但耗費時間和精力，而且無法對微生物進行精確鑒定，不能檢測到微生物群落多樣性的真正概貌[5-6]。因為有些微生物的培養條件非常苛刻，甚至不可培養，常規方法難以檢測到不可培養的微生物。近年來，在微生物群落多樣性研究中已經越來越傾向于采用Illumina MiSeq高通量測序技術[7-10]。高通量測序技術也稱“下一代測序技術”，可同時測序數百萬個核酸分子，根據16S rDNA基因序列分析特定樣品中微生物群落的構成情況[11-12]。目前高通量測序技術已成為監測食品貯藏過程中微生物群落演替、分析發酵及腐敗食品微生物群落結構等食品微生物多樣性研究的首選方法[11]。

本研究以保質期不同的腐敗變質雞蛋干為研究對象，基于Illumina Miseq測序平臺對其16S rDNA V3～V4進行擴增子測序分析，研究其微生物群落結構組成和相對豐度，探究造成雞蛋干腐敗變質的核心優勢微生物以及造成雞蛋干保質期差異的微生物種類，為靶向抑制雞蛋干的腐敗變質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋，北京德青源農業科技股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，美國Omega科技公司；Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；2×Taq PCR MasterMix、DNA Marker，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 儀器與設備

5418R高速離心機，德國Eppendorf公司；拍擊式均質機，法國Interscience公司；RS-400型真空包裝機，北京日上公司；T100 Thermal Cycler 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)儀、PowerPac Basic型電泳儀，美國Bio-Rad公司；ChampGel5000增強型全自動凝膠成像儀，北京賽智創業科技有限公司；Illumina MiSeq測序儀，美國Illumina公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

雞蛋干的制作工藝參照參考文獻[13]，具體為取預處理蛋液于模具中，水浴加熱使其中心溫度達到80 ℃，并維持20 min，待其冷卻收縮后脫模。將雞蛋干樣品真空包裝后，進行90 ℃、30 min滅菌，于25 ℃保存直至變質。預實驗發現，對于使用不同批次原料、于不同的時間點制作的雞蛋干樣品，即使其加工工藝完全一致，樣品的保質期也會有較大差異。為探究不同保質期的雞蛋干樣品中菌群結構的差異，采用上述加工工藝，分別使用不同批次原料,于不同的時間點制作了多批樣品，從其中選取貯藏15 d、22 d和29 d腐敗變質的3批雞蛋干產品，取樣保存于-80 ℃冰箱待測。將3批雞蛋干樣品分別編號為15 d、22 d和29 d，每組樣品設置3個平行。

1.3.2 細菌總DNA的提取

參考高乾坤等[14]的方法，對樣品進行處理后，采用美國Omega公司的細菌基因組DNA提取試劑盒，提取細菌總DNA，提取步驟參照試劑盒產品說明書，并進行1%(質量分數)的瓊脂糖凝膠電泳，以檢測提取效果。

1.3.3 PCR擴增及高通量測序

以檢驗合格的基因組DNA為模板，擴增細菌16S rDNA基因V3～V4區。正向引物為338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)，反向引物為806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。所得PCR產物經2%(質量分數)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果，然后將樣品進行純化并定量檢測。將檢測合格的樣品送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.4 數據分析

對MiSeq測序得到的雙端序列數據進行處理，首先將成對的reads拼接成一條序列，同時對reads的質量和拼接的效果進行質控過濾、得到有效序列，并校正序列方向[15]。

基于操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)聚類分析結果，研究腐敗變質雞蛋干樣品中微生物的多樣性，通過Alpha多樣性檢測單樣本測序深度，并分析微生物群落的豐度和多樣性[16]。基于分類學信息，在各個分類水平上進行群落結構統計，綜合討論保質期不同的雞蛋干樣品中微生物群落結構組成和相對豐度。

2 結果與分析

2.1 測序數據統計與OTU分析

采用Illumina Miseq高通量測序獲得了3種不同保質期雞蛋干樣品的原始序列數據后，經Fastp及FLASH軟件優化數據后得到了9個樣本共529 384條有效序列，序列平均長度為409.70～429.92 bp，主要集中在401～440 bp(圖1-a)。稀釋曲線可反映在高通量測序過程中的樣品取樣深度，因此是評價測序數據量是否全面覆蓋微生物群落的常用指標[14]。為了探究雞蛋干樣品的測序數據量是否科學，從測序獲得的所有原始數據中隨機抽取數據，并統計其物種多樣性指數，得到稀釋曲線(圖1-b和圖1-c)。結果表明,隨著數據量的增加，OTU曲線和Shannon-Wiener曲線的趨勢已經逐漸平緩，即再增加數據量對于發現新物種也無顯著影響。樣本的OTU覆蓋度已經基本飽和，更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小，這個結果說明測序數據量足夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息[17]。

a-樣品序列長度分布圖;b-OTU曲線;c-Shannon-Wiener曲線圖1 樣品序列長度分布圖、OTU曲線和Shannon-Wiener曲線Fig.1 Length distribution profile of trimed sequences, OTU curves and Shannon-Wiener curves

2.2 Alpha多樣性分析

根據97%相似性水平下的OTU信息，采用Alpha多樣性指標的Shannon、Simpson、ACE、Chao1及Coverage指數對雞蛋干樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估[14]。如表1所示，3組樣品的Coverage指數都達到了0.999以上，即樣品文庫的覆蓋率足夠高，有未被檢出序列的可能性較小，表明本次試驗所建文庫能夠較準確地反映出待測雞蛋干的微生物多樣性情況。Chao1、ACE指數用于計算菌群豐度，二者的值越大，說明樣品的群落豐富度越高；Shannon、Simpson指數用于計算菌群多樣性指數，Shannon的值越大，說明樣品群落多樣性越高，而Simpson指數值越大，則說明其群落多樣性越低[18]。22 d組的雞蛋干樣品ACE、Chao1及Shannon指數最高，Simpson值最低，這說明該組樣品的細菌群落豐富度及多樣性高于其他2組樣品，可能由于該組樣品的原料中及加工過程中污染的細菌種類最多；29 d組雞蛋干樣品的ACE、Chao1及Shannon指數均為3組中最小，這說明了該組樣品中細菌群落豐度及多樣性最低，可能由于該組樣品的原料中及加工過程中受到的污染程度較低。綜上，經Alpha多樣性指數統計分析可知，雞蛋干樣品的物種多樣性由高到低依次為22 d組、15 d組和29 d組。此結果顯示，相比于污染的微生物物種的多樣性，雞蛋干所污染微生物的具體種類可能與雞蛋干的保質期相關性更大，這與孫同輝等[11]的報道相一致。

2.3 OTU的Veen分析

基于樣品總OTU數作Veen圖，利用Venn圖可以展示多組樣品間共有和每組樣品特有的OTU數目，并直觀展示樣品間OTU的重疊情況[19]。如圖2所示，15 d組樣品與22 d組樣品共有的OTU數107個，15 d組與29 d組共有的OTU數131個，22 d組與29 d組共有的OTU數92個，3組樣本共有的OTU數為81個，占各樣本OTU數比例較小，而各樣本特有的OTU數在113～259，表明各樣本之間的菌群結構差異性較大。

表1 Alpha多樣性指數Table 1 Alpha diversity indexes

圖2 不同保質期樣品中微生物物種間OUT分析圖Fig.2 OUT analysis diagram of microbial species in samples with different shelf life

2.4 不同保質期雞蛋干樣品細菌群落結構分析

2.4.1 基于門水平的細菌菌群結構分析

在門水平上，3組雞蛋干樣品的群落組成如圖3所示。15 d組的雞蛋干樣品總細菌組成以厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)為主，相對豐度分別為96.73%和1.96%。除此之外還包括少量的放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)微生物。而22 d組的雞蛋干樣品菌群結構以厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為主，相對豐度分別為87.55%、9.41%和1.32%，同時還含有少量的放線菌門微生物。29 d組的雞蛋干樣品中微生物以厚壁菌門(70.94%)、放線菌門(27.81%)和變形菌門(1.09%)為主，還含有少量的擬桿菌門微生物。以上結果表明，在3組不同保質期的樣品中，厚壁菌門的豐度均為最高，可見厚壁菌門是腐敗變質雞蛋干中的優勢微生物。近年來許多研究表明，厚壁菌門微生物是高蛋白食品中的優勢腐敗菌，在乳制品、肉制品及水產品中都十分常見[18-21]，這與本研究的結果一致。

圖3 基于門分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.3 Bacterial distribution pattern at the phylum level

2.4.2 基于科水平的細菌菌群結構分析

基于科分類水平的3組雞蛋干樣品的微生物群落結構如圖4所示。測序結果表明，15 d組的雞蛋干樣品中類芽孢桿菌科(Paenibacillaceae)所占比例最大，為47.43%，其次為芽孢桿菌科(Bacillaceae)和梭菌科(Clostridiaceae_1)，所占比例分別為33.14%和14.96%，還有乳桿菌科(Lactobacillaceae)、伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、假單胞菌科(Pseudomonadaceae)等相對豐度較低的菌種，說明雞蛋干在制作和包裝過程中污染微生物的種類復雜，導致樣品菌落結構呈現多樣性。22 d組的雞蛋干樣品菌群結構以芽孢桿菌科、乳桿菌科、鏈球菌科、伯克氏菌科為主，相對豐度分別為47.39%、29.11%和3.76%、3.29%，除此之外還包括少量的紅桿菌科(Rhodobacteraceae)、假單胞菌科、類芽孢桿菌科微生物。29 d組雞蛋干樣品中的菌群在科水平上主要有芽孢桿菌科(68.85%)和小單孢菌科(Micromonosporaceae，27.60%)，還含有少量的假單胞菌科和伯克氏菌科微生物。以上結果表明，不同保質期雞蛋干樣品所含微生物種類和數量有明顯差異，如相比于其他2組，29 d組樣品中卻未檢出乳桿菌科微生物，可能由于該組樣品的原料中及加工過程中污染的乳桿菌科較少。29 d組雞蛋干樣品的保質期最長，其微生物多樣性低于其余2組，說明樣品中污染的微生物種類和數量與雞蛋干的保質期密切相關。22 d組樣品微生物多樣性最高，但此組保質期不是最短，可能由于樣品中含有豐度較高的乳桿菌科微生物[22-23]，對其他微生物產生拮抗作用、抑制其生長繁殖，相對延長了雞蛋干保質期。此外，在15 d組樣品中檢測出梭菌科微生物，而其他2組中均未檢出，梭菌科中有些菌種為厭氧菌，可在真空包裝雞蛋干中迅速生長繁殖，這可能是本組雞蛋干保質期遠小于其他2組的原因。3組不同保質期的樣品中，均含有芽孢桿菌科微生物，且豐度較高，表明芽孢桿菌科是腐敗變質雞蛋干中的核心優勢微生物。

圖4 基于科分類水平上的樣品菌群分布圖Fig.4 Bacterial distribution pattern at the family level

2.4.3 基于屬水平的細菌菌群結構分析

選取在雞蛋干樣品豐度排名前15的屬，根據其在每組雞蛋干樣品中的豐度信息聚類繪制成熱圖(圖5-a)。熱圖可通過顏色變化直觀地反映出各組雞蛋干樣品群落組成的相似性和差異性，更便于發現在各組樣品中分布較多或較少的菌屬[10]。圖中顏色越偏磚紅色，表明樣品中所含該菌屬比例越高，顏色越偏深藍色，比例則越低。如圖5-a所示，在屬水平，22 d組和29 d組聚為一類，15 d組單獨聚為一類，說明22 d組和29 d組菌群整體結構相似度較高，與15 d組相似度較低，表明雞蛋干樣品的保質期與其菌群結構相關性較大。

從圖5-b各樣品菌群柱狀分布圖中可以看出，在屬水平上，15 d組優勢菌群主要是芽孢桿菌屬 (Bacillus，33.14%)、短芽孢桿菌屬(Brevibacillus，30.96%)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus，16.46%)和狹義梭菌屬(Clostridium_sensu_stricto_13，14.86%)。在優勢菌群中，芽孢桿菌屬所占比例最大，它屬于需氧或兼性厭氧菌，此屬中大部分細菌為腐生菌，廣泛分布于自然環境中。該菌屬可形成芽孢，對不良環境條件有很強的抵抗力，不易殺滅。賀燕等[3]在腐敗雞蛋干中也有檢測到芽孢桿菌屬微生物。短芽孢桿菌屬為需氧或兼性厭氧菌，近年來相關報道多集中于該屬工程菌株的研究，鮮見有研究發現其在食品腐敗中的作用[24-25]。類芽孢桿菌屬為需氧或兼性厭氧菌，近年來許多研究表明，其為多種乳制品和即食食品的腐敗微生物[26-27]。狹義梭菌屬廣泛分布于土壤、下水污泥、人和其他哺乳動物的腸道等環境中，是乳制品和肉制品中常見的腐敗微生物[20, 28-29]。

22 d組優勢菌群主要是芽孢桿菌屬(47.38%)、乳桿菌屬(Lactobacillus，28.26%)和鏈球菌屬(Streptococcus，3.57%)。乳桿菌屬為兼性厭氧菌，廣泛分布于自然界中，污染乳制品、肉制品、水產品等高蛋白食品后可引起腐敗變質。鏈球菌屬為兼性厭氧菌，該屬中有少數種為腐生菌，污染食品后可引起腐敗變質[29]。

a-樣品菌群相對豐度熱圖;b-樣品菌群相對豐度柱形圖圖5 基于屬分類水平上的樣品菌群相對豐度熱圖 和柱形圖Fig.5 Heat map and stacked-column of relative abundances of bacterial communities at the genus level

29 d組優勢菌屬主要是芽孢桿菌屬(68.85%)和小單孢菌屬(Micromonospora，27.60%)。小單孢菌屬為好氧或微好氧的腐生菌，是土壤和水域的常見微生物群體[30]，其在真空包裝雞蛋干中占比達到27.60%，可能由于雞蛋干中初始污染小單孢菌屬較多，且微好氧微生物能在較低的氧分壓下生長，雞蛋干雖然經過真空包裝，但仍無法將樣品中氧氣完全排出，因此小單孢菌屬中部分微好氧菌種可以生長。

以上結果表明，在3組不同保質期的樣品中，芽孢桿菌屬的相對豐度均為最高，可見芽孢桿菌屬是雞蛋干的核心致腐微生物。保質期最長的29 d組樣品中優勢菌屬為芽孢桿菌屬和小單孢菌屬，其中小單孢菌屬為好氧或微好氧菌，在真空包裝雞蛋干中生長緩慢，而芽孢桿菌屬中部分菌種為兼性厭氧菌，可在真空包裝條件下良好生長，因此芽孢桿菌屬應為限制此組樣品保質期的微生物。而相比于29 d組，22 d組樣品中還含有較高豐度的乳桿菌屬，這可能是造成本組雞蛋干保質期<29 d的原因。此外，狹義梭菌屬僅在保質期為15 d的雞蛋干樣品中檢測到，它屬于厭氧菌，因此在真空包裝雞蛋干中的生長速度大于非厭氧菌，可快速分解雞蛋干中營養物質造成腐敗變質，這可能是15 d組雞蛋干保質期遠低于其他2組的原因。

3 結論

本研究以保質期不同的3組腐敗變質雞蛋干為研究對象，采用Illumina Miseq高通量測序技術分析樣品中菌群組成情況。結果表明，3組腐敗變質雞蛋干的微生物的多樣性以及豐度存在較大差異，而總體來看，厚壁菌門為腐敗變質雞蛋干的優勢菌門，芽孢桿菌科為優勢菌科。在屬水平，芽孢桿菌屬在3組樣品中的相對豐度均為最高，是雞蛋干的核心致腐微生物。此外，造成雞蛋干保質期差異的菌屬包括乳桿菌屬和狹義梭菌屬，它們可加速雞蛋干的腐敗變質，是雞蛋干保質期的限制因素，應在殺菌防腐環節重點關注。高通量測序技術檢測不同保質期雞蛋干樣品的微生物組成，不僅可以分析雞蛋干腐敗過程中的核心優勢菌群，還可以高效快速地分析樣品中微生物種類的差異，為今后雞蛋干質量安全監測及靶向研究雞蛋干防腐保鮮技術提供理論依據。