漆酶LAC表達與鴨梨果心褐變的關系

王梓宇，張引引，李月圓，李玲,4，尤玲玲,4，李曉雁,4，晉朝，閆師杰,4

漆酶表達與鴨梨果心褐變的關系

王梓宇1，張引引2，李月圓3，李玲1,4，尤玲玲1,4，李曉雁1,4，晉朝5，閆師杰1,4

（1天津農學院食品科學與生物工程學院，天津 300384；2天津農學院園藝園林學院，天津 300384；3山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801；4天津市農副產品深加工技術工程中心，天津 300384；5天津森羅科技股份有限公司，天津 300409）

【】探究在不同成熟度和降溫貯藏方式下，表達模式與鴨梨果心褐變的關系，為進一步解析鴨梨果心褐變機制提供理論依據。以鴨梨作為材料，通過對不同成熟度（早采、中采和晚采）的鴨梨進行急速降溫（急降）和緩慢降溫（緩降）處理，觀察貯藏期間鴨梨果心褐變情況，測定漆酶（Laccase，LAC）活性及其基因的相對表達量，研究在鴨梨果心褐變過程中的參與作用。冷藏60 d時，晚采鴨梨出現褐變，晚采緩降處理的鴨梨果心褐變指數為0.32，是同期急速降溫處理的2.56倍；在貯藏90 d時，中采緩降處理的褐變指數是0.24，中采急降處理的褐變指數僅為0.01。各個處理組在貯藏期間LAC活性多數表現為先逐漸升高后下降的趨勢，晚采的果實在貯藏60 d時出現活性高峰，褐變發生；早采和中采鴨梨LAC活性高峰均在90 d時出現，褐變程度低于晚采鴨梨。在貯藏期間，緩慢降溫處理的LAC活性高于急速降溫處理。鴨梨和表達量呈先上升后下降的趨勢，表現為先下降后上升再降低的變化趨勢；中采、晚采鴨梨在貯藏60 d時，和表達量最高。與緩慢降溫相比，急速降溫處理減少了鴨梨果心褐變的發生。在整個貯藏期間，LAC活性呈先上升后下降然后又上升的趨勢，其峰值時的活性高低次序為：晚采>中采>早采，這與果心褐變趨勢一致；在鴨梨果心褐變過程中上調表達。相比緩慢降溫處理，急速降溫處理具有較低的、和表達量。急速降溫結合適時采收能夠抑制的上調表達，減少鴨梨果心褐變發生。

鴨梨；果心褐變；降溫方式；漆酶；

0 引言

【研究意義】鴨梨（Rehd cv. Yali）是我國北方栽培的主要梨品種，具有果肉細嫩多汁，香氣誘人，耐貯運等優點[1]，深受人們喜愛。但鴨梨果心在采后貯藏過程中易出現黑心，即近果心部位發生褐變，嚴重影響其貯藏品質和食用口感，制約其銷售，造成經濟損失。果實采后果心褐變速度和程度是影響鴨梨果品品質和貨架期壽命的重要因素。褐變依據采收期不同，可分為早期褐變和晚期褐變[2]。早期褐變原因通常被認為是冷敏性褐變，晚期褐變多認為是衰老型褐變[3]。鴨梨果心褐變是一個復雜的調控過程，是各種相關酶和基因共同調控的結果。因此，了解其內在調控機制，為研究開發鴨梨采后保鮮新途徑提供理論和依據。【前人研究進展】酶促褐變是引發鴨梨褐變的首要原因[4]。鴨梨采后貯藏中，果實逐漸衰老，硬度下降，膜脂過氧化作用加強，對膜系統造成損傷，多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）及其底物酚在細胞內的區域化被打破，酚與PPO接觸反應，發生酶促褐變[5-7]。PPO與酶促褐變密切相關，有氧環境下，酚類物質與PPO反應生成醌類物質，醌類物質可進一步被氧化成黑色聚合物，也可自身聚合，還會與氨基酸等大分子絡合產生褐色物質，在果蔬組織內不斷積累，發生褐變[8]。何利華[9]研究證實，鴨梨中的PPO同工酶與鴨梨果實褐變密切相關，并采用RT-PCR技術，克隆得到一條1 780 bp的產物，其與鴨梨的同源性高達99%。這為進一步研究鴨梨基因家族提供了理論基礎。李曉丹等[10]研究了鴨梨果肉中的脂氧合酶（LOX）同工酶，不同處理下鴨梨貯藏中果實LOX酶活性與LOX酶譜帶不同，其中9條與果肉褐變有關，主酶帶有3條，分別是B、C、G。樊曉嵐等[11]研究降溫方式下脂肪酸去飽和酶基因和表達變化發現，急速降溫增加了FAD和LOX活性與基因表達量，使鴨梨機體受到冷害，導致果心不飽和脂肪酸含量與脂肪酸不飽和度升高，促進了果心的褐變。漆酶（Laccase，LAC）是具有催化酚類結構物質和芳香族氨基酸的一種含銅多酚氧化酶[12-13]，與兒茶酚結構類似的酚類化合物都可以作為底物被漆酶氧化，而兒茶酚是鴨梨、蘋果、柿子等水果的褐變底物之一[14]。FANG等[15]研究證實漆酶降解花色苷，使褐色物質在荔枝果皮中生成并積累，促進果皮褐變。蔣躍明[16]研究發現，漆酶主要催化荔枝果皮中的多酚類化合物，表兒茶素等，導致果皮黑色素積累，褐變加重，漆酶活性與荔枝果皮褐變率呈顯著正相關。植物中漆酶通常由多個基因共同調控，有學者已在擬南芥中共發現17個漆酶基因[17]。此外，亞麻[18]、甜高粱[19]、水稻[20]和楊樹[21]等也發現了漆酶基因家族。【本研究切入點】國內外鴨梨褐變的研究中未出現過與漆酶導致褐變有關的內容，本研究通過對轉錄組數據的分析，結合其他果蔬的褐變機理，在鴨梨褐變過程中挖掘出不同于以往的引起褐變的關鍵酶—漆酶，并探究不同處理下漆酶對鴨梨褐變過程的影響。【擬解決的關鍵問題】結合褐變指數、LAC活性及相對表達量三者之間的關系，深入探究鴨梨果心褐變的分子機理，旨在為探索在鴨梨果心褐變中的調控作用提供理論依據，為今后更加深入解析褐變機理奠定分子基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨梨采自河北省深州市大城北村，挑選大小均勻，無機械傷、無蟲害的果實為材料。采摘時間：2017年9月6日、9月16日和9月26日，分別稱為早采、中采和晚采鴨梨。采摘當天運回冷庫。

早采、中采和晚采鴨梨分別采用急速降溫（急降）和緩慢降溫（緩降）兩種處理方式，急速降溫指去除田間熱的鴨梨直接放入（0±1）℃貯藏；緩慢降溫是指將鴨梨預冷后置于12℃冷庫中，每5 d降2℃，用30 d時間降為0℃。將采收期與降溫方式結合起來分為早采急降（早急）、早采緩降（早緩）、中采急降（中急）、中采緩降（中緩）、晚采急降（晚急）、晚采緩降（晚緩）6個處理組，每個處理10箱，每箱約150個果。每隔30 d，從每箱中取出3個果實，10箱共取30個果實，觀察并記錄鴨梨果心褐變情況，用液氮對鴨梨果心組織樣品進行速凍，置于-80℃中保存備用。

1.2 方法

1.2.1 果心褐變指數的測定 參考YAN等[22]的方法，褐變指數計算方法為褐變級別與該級別果的乘積除以最高褐變級別與檢查總果數的乘積。

1.2.2 LAC活性測定 參照FLOCH等[23]的方法，略作修改。稱取4 g鴨梨果心凍樣，冷凍磨成粉末狀后轉移至試管中，加入醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）100 mL，震蕩后靜置15 min，過濾離心得到酶粗提液。酶活性測定：取粗酶液0.1 mL，加入2.5 mL醋酸鈉緩沖液（pH 4.5）混勻后，加入0.4 mL ABTS溶液，反應30 s后開始計時，每15 s測定一次OD420值的變化。設置3次重復。

1.2.3 果心總RNA提取與定量測定 從5個鴨梨果心組織混合凍樣中，稱取1 g，使用Probe Gene MM032 RNA提取試劑盒進行總RNA提取；提取后利用1%瓊脂糖凝膠對RNA的完整性進行檢驗。然后取1 μg總RNA，利用寶生物RR047A試劑盒進行反轉錄，合成cDNA。

以鴨梨中肌動蛋白（Actin）基因（NW_ 008988406.1）作為內參基因[24]。根據引物設計原則，使用Primer 5設計、、引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如表1。依據樊曉嵐等[11]的基因定量檢測方法，用熒光定量PCR儀（CFX-Connect）確定熒光定量PCR反應體系為：SYBR Premix Ex TaqTMII 12.5 μL，Forward Primer 2 μL，Reverse Primer 2 μL，cDNA 1μL，dH2O 7.5 μL（反轉錄之后cDNA已經定量，實時定量取等體積cDNA，即等濃度）。反應程序為：95℃預變性 30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，共計30個循環。最后以鴨梨為內參基因，以初始（貯藏0 d）樣品中相關基因表達量為標尺，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.3 數據分析

數據采用Excel 2010軟件進行統計分析，SPSS17.0進行差異顯著性檢驗，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 不同處理對鴨梨貯藏期果心褐變指數的影響

貯藏過程中，用褐變指數表示鴨梨果心褐變變化情況。由圖1可知，隨著貯藏時間的延長，不同處理組鴨梨果心褐變指數均呈增長趨勢。貯藏60 d時，急速降溫和緩慢降溫的晚采鴨梨處理組以及緩慢降溫的中采鴨梨處理組均出現了褐變，褐變指數分別約為0.1、0.2和0.1；而急降和緩降的早采處理鴨梨及中采急降處理鴨梨在90 d才出現輕微褐變，較中緩、晚急和晚緩處理組褐變晚出現約30 d。貯藏120 d后，急降和緩降早采處理鴨梨組褐變指數顯著低于其他4個處理組（<0.05），且褐變指數一直處于較低水平；早急和早緩兩個處理組相比，急速降溫處理褐變指數顯著低于緩慢降溫處理組（<0.05）。貯藏到后期，晚采緩降處理組褐變指數維持在較高水平，且在210 d到達峰值（0.64）。在整個貯藏期間，晚采鴨梨果心褐變指數最高，中采次之，早采最低。緩降的鴨梨果心褐變指數顯著高于急降處理（<0.05）。說明早采鴨梨果心褐變程度輕，緩慢降溫加速褐變。

2.2 不同處理對鴨梨果心LAC活性的影響

由圖2可知，各個處理組在貯藏期間LAC活性先逐漸升高后下降，晚采鴨梨在60 d時出現活性高峰，急速降溫和緩慢降溫處理峰值分別為6.22和7.32 μmol·h-1·mL-1，早采和中采鴨梨活性高峰均在90 d出現，晚采緩降處理的峰值最大，其果心褐變程度也最高。不同成熟度鴨梨緩慢降溫處理的LAC活性比急速降溫的活性高，急速降溫可以很好地抑制鴨梨采后果心的LAC活性，從而抑制鴨梨果心褐變。因此，晚采的果實LAC活性較高，尤其晚采緩降處理鴨梨的活性最高，果實褐變最嚴重。

*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）

圖2 不同處對理鴨梨果心LAC活性的影響

2.3 不同處理對鴨梨果心褐變相關LAC表達的影響

不同處理的鴨梨在貯藏期間的表達量如圖3所示。整體上，鴨梨和表達量呈先上升后下降的趨勢，多數情況下呈先下降后上升再降低的趨勢。隨著貯藏時間的延長，緩慢降溫處理鴨梨果心相對表達量先上升后下降，最后又呈現上升趨勢。晚采急速降溫處理的鴨梨果心和的表達量在貯藏60 d時突然升高。中采和晚采處理的鴨梨在60 d時表達量達到最高。急速降溫處理顯著降低的表達量，中采處理果實貯藏60 d時，急速降溫果表達量僅為0.37，而緩慢降溫處理的為1.36，中采鴨梨兩種降溫方式表達差異較大。在不同成熟度鴨梨中，表達量表現為：早采<中采<晚采；和表達量變化趨勢和LAC活性變化基本一致。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05） Different lowercase letters indicate significant difference (P＜0.05)

3 討論

酚類物質、酶、氧是導致酶促褐變必不可少的3個因素，正常情況下，由于細胞具有空間結構性，酶與底物無法接觸，不會發生褐變，但當植物遭受逆境傷害時，細胞膜受到破壞，三者接觸引發褐變反應。賀立紅等[25]和霍君生等[6]對鴨梨的研究也表明果實褐變和細胞膜系統的穩定性相關。目前大多數研究都認為，果實褐變的根本原因是隨著果實的衰老和受低溫等外界因素的脅迫傷害，活性氧自由基清除酶系統的活性下降，使活性氧自由基含量增加，打破植物體內動態平衡，進而加劇細胞膜的破壞，使酚類物質與PPO接觸，形成褐色聚合物，從而加劇褐變[26-27]。PPO是酶促褐變發生的關鍵酶，其包括3種類型，即單酚氧化酶、雙酚氧化酶以及漆酶；不同果實的PPO性質不同，如枇杷果實PPO能氧化鄰位酚、綠原酸等，但不能氧化對位酚、間位酚，屬于雙酚氧化酶[28]；而荔枝果皮、鴨梨果心、香梨果皮PPO能氧化鄰苯二酚和對苯二酚，但不能氧化一元酚和間苯二酚，表現為漆酶的特性[29]。漆酶作為多酚氧化酶的一種，在果實的褐變過程中起著重要作用。前人研究發現，在嚴重褐變的荔枝果皮中過度表達，且隨果皮褐變指數升高而升高[30]。龍眼果皮中表達量上升，其漆酶活性升高，褐變程度加劇[31]。

漆酶主要存在于完整的細胞區域，包括液泡、葉綠體、白色體等中[32]，在貯藏初期果實中的LAC主要以結合態形式存在，當植物受到逆境傷害或隨著貯藏時間的延長，果實逐漸走向衰亡時，LAC和底物的區域被打破，LAC便從細胞膜上脫離出來，轉變為參與氧化反應的游離態，增強了LAC活性，活性升高，加速了酚類物質的氧化，從而導致褐色物質的積累，加速了褐變[29]。本研究中LAC對鴨梨果心褐變也表現為促進作用，在急速降溫和緩慢降溫處理貯藏過程中，LAC活性均呈先升后降然后又輕微上升的趨勢。結合果心褐變指數變化分析，晚采緩慢降溫處理果在60 d時褐變指數從0變為0.2，褐變發生。可能是由于在貯藏60 d時，LAC活性達到最大，加速了酚類物質的氧化，進而導致褐色物質的產生，褐變發生，而急速降溫果褐變指數顯著低于緩慢降溫處理組，這與急速降溫處理果LAC活性低于緩慢降溫處理果關聯密切。本研究發現，晚采鴨梨和表達量均在60 d達到最大，這與果心褐變出現的時間一致，且和表達量變化趨勢和LAC活性基本一致，這也表明導致了鴨梨果心褐變的發生。中采鴨梨急速降溫和緩慢降溫處理果表達量差異顯著，說明對降溫方式比較敏感，緩慢降溫可誘發表達，加速褐變。這與周一鵬[32]在柑橘漆酶家族中作用模式研究一致。表達量先下降再上升然后又降低，可能參與果實后期的褐變過程，需要進一步的研究證實。

4 結論

急速降溫處理較緩慢降溫處理有助于減少鴨梨貯藏期間果心褐變發生。不同采收期果實的果心褐變程度表現為：晚采>中采>早采。晚采果實的LAC峰值較高，尤其是結合晚采緩降處理時活性最高，早采果實的LAC活性處于較低水平；急速降溫能保持較低的LAC活性，以及較低的、和表達量，減少果心褐變。表明鴨梨（、和）表達水平和酶活性變化與果心褐變密切相關。

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Relationship Between LAC Gene Expression and Core Browning of Yali Pear

WANG ZiYu1, ZHANG YinYin2, LI YueYuan3, LI Ling1,4, YOU LingLing1,4, LI XiaoYan1,4, JIN Zhao5, YAN ShiJie1,4

(1College of Food Science and Biological Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384;2College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384;3College of Food Science and Engineering, Shanxi Agricultural University, Jinzhong 030801, Shanxi;4Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing,, Tianjin 300384;5Tianjin CNRO Science & Technology CO. ,Ltd., Tianjin 300409)

【】 The aim of this study was to explore the relationship between LAC gene expression patterns and core browning of Yali pear under different maturity and cooling storage methods, so as to provide a theoretical basis for further analysis of the mechanism of Yali core browning.【】Using Yali pear as the material, the Yali pears of different maturity levels (early harvesting, middle harvesting and late harvesting) were treated with rapid cooling and slow cooling to observe the core of the pear during storage. For browning situation, the activity of LAC and the relative expression of LAC gene were determined, and the role of LAC gene in the browning process of Yali pear core was studied.【】 When the Yali pear samples were refrigerated for 60 days, the late-harvested pears browned, and the browning index of late-harvested pears gradually decreased was 0.32, which was 2.56 times the rapid temperature drop during the same period; after 90 days of storage, the middle-harvested browning index decreased slowly, and the index was 0.24, and the browning index of the medium mining was only 0.01. During the storage period, the LAC activity of each treatment group increased gradually and then decreased. The late harvested fruits showed a peak activity and browning occurred after 60 days of storage. The peak of LAC activity of early harvesting and middle harvesting Yali pears appeared in 90 days, and the degree of browning was lower than that of late harvesting Yali. During the storage period, the activity of slow cooling LAC was higher than that of rapid cooling. The LAC14 and LAC7 gene expressions of Yali pears increased first and then decreased. LAC6 realized a change trend of first decline, then increased and then decreased; the expression of LAC14 and LAC7 genes reached the highest when the middle and late harvested pears were stored for 60 days.【】Compared with slow cooling, rapid cooling treatment reduced the browning of Yali fruit core. During the whole storage period, the activity of LAC showed a trend of rising first, then falling, and then rising again, and the order of activity at its peak was: late harvesting>medium harvesting>early harvesting, which was consistent with the browning trend of the core.LAC was in the Yali fruit Up-regulated expression during heart browning. The rapid cooling was slower than the slow cooling, and the expression of LAC7, LAC14 and LAC6 genes was lower. A timely harvesting with the rapid cooling could inhibit the up-regulated expression of LAC and reduce the browning of Yali pear core.

Yali pear; core browning; cooling method; laccase; LAC gene

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.010

2020-02-29；

2020-10-30

國家自然科學基金面上項目（32072278）、農業部公益性行業（農業）科研專項（201303075）、天津市林果現代產業技術體系創新團隊（ITTFPRS2018009）

王梓宇，E-mail：prince1893@yeah.net。通信作者閆師杰，E-mail：yanshijie@126.com

（責任編輯 趙伶俐）