可可毛色二孢全基因組分泌蛋白的預測及分析

邢啟凱，李鈴仙，曹陽，張瑋，彭軍波，燕繼曄，李興紅

可可毛色二孢全基因組分泌蛋白的預測及分析

邢啟凱1，李鈴仙1，曹陽2，張瑋1，彭軍波1，燕繼曄1，李興紅1

（1北京市農林科學院植物保護環境保護研究所/北方果樹病蟲害綠色防控北京市重點實驗室，北京 100097；2大連理工大學生物工程學院，遼寧大連 116024）

【】可可毛色二孢（）是一種世界性分布的重要植物病原真菌，可引起嚴重的葡萄潰瘍病（Botryosphaeria dieback），影響果木品質并造成巨大的經濟損失。本研究預測并分析可可毛色二孢基因組范圍內的分泌蛋白，并明確其基本特征，為該病菌分泌蛋白致病機理的研究打下基礎。依據已公布的可可毛色二孢全基因組序列，利用信號肽預測軟件SignalP v5.0、跨膜結構分析軟件TMHMM v2.0、細胞器定位分析軟件ProtComp v9.0、GPI錨定預測軟件big-PI Fungal Predictor和亞細胞器定位分析軟件TargetP v2.0生物信息學軟件對該菌中的典型分泌蛋白進行篩選。對分泌蛋白N端信號肽的長度、氨基酸使用頻率及其切割位點進行統計分析。依據蛋白序列的同源性，應用BLASTP程序對分泌組蛋白進行功能注釋分析，預測其生物學功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系統，對所選分泌蛋白的信號肽進行活性檢測。利用qRT-PCR方法檢測所選分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表達情況。在可可毛色二孢全基因組編碼蛋白中共篩選獲得552個潛在的具有典型信號肽的分泌蛋白，占全基因組預測蛋白總數的4.3%，其編碼蛋白長度集中于101—400 aa。信號肽統計分析表明，其信號肽長度以18—20 aa的序列最為集中，信號肽長度為20 aa的蛋白數量最多。信號肽中使用頻率最高的氨基酸為丙氨酸；非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高，占氨基酸總數的60.2%。其信號肽的-3至-1位置上的氨基酸相對保守，切割位點屬于A-X-A類型，可被Sp I型信號肽酶識別并切割。336個分泌蛋白具有功能注釋，其功能較多集中于細胞壁降解有關的酶類以及致病相關蛋白，并且這些蛋白在分子量、等電點、脂肪族氨基酸指數等方面均存在差異。通過蔗糖酶缺陷的酵母分泌系統證實，挑選的9個分泌蛋白信號肽均具有分泌活性。qRT-PCR檢測結果表明，所選分泌蛋白基因在該病菌侵染初期的表達發生變化。利用生物信息學分析技術從可可毛色二孢全基因組中共預測獲得552個經典分泌蛋白。其信號肽氨基酸長度分布廣泛，氨基酸組成中非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高。功能注釋主要集中在細胞壁組分降解相關的酶類、致病侵染相關的壞死誘導相關蛋白以及幾丁質結合蛋白等。

葡萄潰瘍病；可可毛色二孢；生物信息學；分泌蛋白；信號肽；表達模式

0 引言

【研究意義】葡萄潰瘍病（Botryosphaeria dieback）是葡萄（）生產上最重要的枝干病害之一，在世界葡萄主產區造成巨大的經濟損失[1]。通常認為，該類型病原真菌主要通過自然孔口或修剪傷口侵入，感病果木出現枝干潰瘍、果梗干枯、果實干縮、掉粒以及樹勢減弱等癥狀，更嚴重的會引起根腐，造成整株果木枯死[2]。至今，在我國葡萄產區共分離獲得6種葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）真菌可引起葡萄潰瘍病，其中優勢種群為可可毛色二孢（）和葡萄座腔菌（），而致病力最強的為可可毛色二孢[3-5]。目前普遍使用化學藥劑防治葡萄潰瘍病，但至今沒有獲得低毒環保并能夠高效防治該病害的有效藥劑。病原真菌分泌蛋白（secreted protein）在病原真菌與宿主植物的互作中起著至關重要的作用，其直接影響病原菌的侵入、擴展、定殖以及病害發生[6-7]。可可毛色二孢全基因組范圍內分泌蛋白的篩選鑒定，將對揭示其致病機理，進一步制定葡萄潰瘍病的防治新策略具有重要意義。【前人研究進展】分泌蛋白是指在病原菌體內合成后，通過內質網/高爾基體等分泌途徑轉運到宿主細胞質膜外空間或細胞內發揮功能的蛋白分子[8-9]。經典的分泌蛋白具有以下特征[10]：（1）氨基酸N端含有信號肽序列；（2）無糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定位點；（3）沒有跨膜結構域；（4）沒有將蛋白輸送至葉綠體、線粒體等胞內細胞器的定位信號。研究表明，在病原真菌的侵入、擴展和定殖等致病過程中，往往有大量的分泌蛋白參與其中，扮演著重要角色[11-12]。例如，在侵入宿主植物期間，病原真菌可以分泌大量的植物細胞壁降解酶、蛋白水解酶和代謝相關酶等酶類以及激發子蛋白，進而降解植物細胞壁以及植物細胞內復雜的碳氮化合物，一方面獲得營養物質供病原菌生長，促使其在宿主中的侵入、定殖和擴散；另一方面阻礙或抑制宿主植物的免疫系統，從而完成其致病過程[9,13]。病原物來源的分泌蛋白與宿主植物受體蛋白的識別和信號傳導研究是揭示病原物與宿主互作機制的關鍵點[14-15]，因而研究者完成了多種病原菌全基因組水平的分泌蛋白預測研究[16-21]，為其他病原菌分泌蛋白的預測及分析提供了參考。【本研究切入點】目前，關于葡萄潰瘍病的研究主要集中在病原真菌的種類鑒定、種群結構、侵染過程以及毒素分泌等方面，關于其病原菌分泌蛋白的研究尚未報道。實驗前期首先應用SOAPdenovo組裝軟件對可可毛色二孢菌株CSS-01s進行了測序組裝分析[13]，其全基因組大小為43.3 M，測序深度為90X，GC含量為54.77%[22]。通過組裝拼接共獲得60條contigs和29條scaffolds，并且通過基因軟件預測并與各數據庫比對共注釋獲得12 902個蛋白序列[22]。【擬解決的關鍵問題】在已公布的可可毛色二孢菌株CSS-01s全基因組信息的基礎上[22]，根據分泌蛋白典型特征，利用生物信息學在線程序進行預測分析，以期獲得所有可編碼經典分泌蛋白的相關基因，為揭示葡萄與可可毛色二孢等葡萄座腔菌科真菌互作的分子機制，并進一步持續有效地開展葡萄潰瘍病的防控打下基礎。

1 材料與方法

試驗于2018—2019年在北京市農林科學院完成。

1.1 供試材料

供試可可毛色二孢菌株CSS-01s為課題組分離、單孢純化、鑒定并保存。可可毛色二孢12 902個蛋白序列來源于PRJNA339237（accession number SRP107819）[22]。一年生葡萄‘夏黑’（Summer Black）綠枝條由北京市林業果樹科學研究院提供。酵母信號序列誘捕載體pSUC2T7M13ORI（pSUC2）、對照載體和酵母菌株YTK12（suc2）由中國農業大學植物保護學院孫文獻教授提供。

1.2 分泌蛋白篩選程序

應用SignalP v5.0[23]（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）軟件在線分析可可毛色二孢全基因組的蛋白序列是否含有N端信號肽以及該信號肽的切割位置；利用Protcomp v9.0[24]（http://www.softberry.com/）在線分析軟件進行亞細胞定位，獲得其在亞細胞器的定位和分布；利用在線TMHMM v2.0[25]（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）軟件對候選序列的跨膜結構域進行分析；利用在線軟件big-PI Fungal Predictor[26]（http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）實現蛋白質的GPI錨定修飾位點的預測；使用在線程序TargetP v2.0[27]（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進一步分析靶標蛋白在亞細胞器中的定位和分布情況，以排除非胞外蛋白；利用LipoP v1.0[28]（http:// www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）在線軟件對分泌蛋白進行信號肽酶識別位點的預測；利用ExPAS[29]（http://web.expasy.org/protparam/）在線軟件預測分泌蛋白的理化性質。

1.3 分泌蛋白信號肽功能分析

1.3.1 載體構建 參照Jacobs等[30-31]方法，用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系統對預測的分泌蛋白信號肽的功能進行分析驗證。根據可可毛色二孢效應子序列信息，用生物信息學在線程序SignalP v5.0進行預測分析所選效應子的信號肽區域，信號肽通常是位于蛋白質N端、大小為40個氨基酸的多肽。依據該目的區段，利用Primer5.0在線程序設計載體構建所需的特異性引物，并在引物5′和3′端分別添加R I和I酶切位點，保證目的片段可單方向插入功能質粒。Trizol（Invitrogen）法提取可可毛色二孢的RNA，反轉錄得到cDNA。以此為模板進行PCR擴增，對表1所選的9個候選分泌蛋白信號肽片段進行擴增，反應程序：95℃預變性3 min；進入95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共32個循環；72℃延伸10 min。所用引物見表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。用R I和I酶切PCR片段，將回收產物連接到pSUC2相同的酶切位點間，隨后對克隆進行PCR篩選鑒定，最后將重組質粒送北京擎科新業生物技術有限公司進行測序驗證。

1.3.2 酵母感受態的制備與載體轉化 依照Frozen- EZ Yeast Transformation II kitTM（Zymo Research，Orange，CA，USA）提供的方法制備蔗糖酶缺陷型酵母YTK12菌株的感受態，具體方法參照試劑盒說明書。將酵母YTK12菌株在YPDA平板上劃線，30℃培養3—5 d；挑單斑至YPDA液體培養基搖培，直到OD600=0.7—0.8，收集菌液，用E1懸浮；再次離心倒掉上清，加入500 μL的E2，即為制備好的YTK18感受態，-80℃保存備用。

將構建好的載體、陽性對照載體pSUC2-Avr1b以及陰性對照載體pSUC2-Mg87分別轉化到酵母YTK18感受態中，涂到CMD-W培養基（0.67%不含氨基酸的酵母氮源、0.075%色氨酸一缺培養基、0.1%葡萄糖、2%蔗糖和2%瓊脂）上培養3—5 d。將篩選獲得的轉化子劃線到YPRAA培養基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2 μg·L-1的抗霉素A、2%棉籽糖和2%瓊脂）上培養3—5 d，通過觀察酵母菌在YPRAA上的生長狀況來判斷所選分泌蛋白的信號肽是否具有分泌功能。

表1 分泌蛋白信號肽活性測定載體構建引物序列

1.4 可可毛色二孢侵染下分泌蛋白基因的表達分析

參考Yan等[3,22]接種葡萄座腔病菌的方法，用可可毛色二孢CSS-01s菌株接種一年生葡萄‘夏黑’綠枝條，于接種后0、6和12 h取接種點0.5—2 cm葡萄枝條表皮，液氮凍存后于-80℃冰箱保存備用。組織經液氮充分研磨后，用EASYspin Plus多糖多酚復雜植物RNA提取試劑盒（艾德萊生物）提取總RNA，經DNase I（TaKaRa）處理后，用SuperScript III反轉錄酶（Invitrogen）反轉錄得到第一鏈cDNA，-20℃保存，用于后續的實時熒光定量PCR分析（qRT-PCR）。依據全基因組預測的分泌蛋白序列設計特異性引物（表2），以（KAB2581229.1）作為內參基因，進行qRT-PCR分析。采用SYBR Green I熒光染料法，試驗過程參照TaKaRa說明書。20 μL反應體系：2×TB GreenII（Tli RNaseH Plus）10 μL，正反引物（0.5 μmol·L-1）3.5 μL，cDNA 0.5 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，補水至總體積為20 μL。qRT-PCR在ABI7500儀器上進行。反應程序：95℃ 5 min；進入95℃ 30 s，60℃ 30 s，共45個循環。每個反應得到相應的Ct值。每個樣品進行3個平行反應，取均值后，用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達量。

2 結果

2.1 可可毛色二孢全基因組水平的分泌蛋白篩選鑒定

基于可可毛色二孢全基因組測序數據[22]，對12 902條蛋白序列，通過SignalP v5.0[23]預測得到937個在氨基端含有典型信號肽序列的蛋白，占全基因組蛋白序列總數的7.26%。隨后以ProtComp v9.0[24]在線程序對這937個含有信號肽的蛋白序列的細胞定位進行預測分析，結果如圖1所示，共有685個蛋白可轉運至細胞外，是胞外分泌蛋白類型，占比73%；另有252個蛋白未分泌到細胞外，其中最多的72個蛋白序列轉運至細胞質膜（7.7%），其次是轉運至線粒體（7.5%）、溶酶體（3%）和細胞質（2.9%）；另外轉運至過氧化酶體、細胞核、內質網和液泡的共有39個，占比4.2%。

表2 實時熒光定量PCR所用引物序列

為了排除含有跨膜結構域的蛋白序列，通過TMHMM v2.0在線軟件[25]對氨基端含有典型信號肽的蛋白序列進行跨膜螺旋結構分析，結果如圖2所示，該685個蛋白序列中，有576個蛋白序列不含跨膜結構域，占比84.1%；有98個蛋白序列只含有1個跨膜結構域，占比14.3%；其余11個蛋白序列含有2—3個跨膜結構域，占比1.6%。

圖1 可可毛色二孢中937個具有信號肽蛋白的亞細胞定位

圖2 可可毛色二孢中685個外泌蛋白的跨膜結構域分析

為了在預測蛋白中將這一部分蛋白去除，對576個蛋白序列進一步應用big-PI Fungal predictor[26]在線軟件進行GPI錨定位點預測分析，結果發現552個蛋白序列不具有GPI錨定位點，而24個蛋白含有GPI錨定位點。通過對以上552個非GPI錨定蛋白序列測試發現，這552個測試蛋白序列均具有胞外分泌途徑信號肽（SP）。

綜合運用上述5種生物信息學算法程序，對可可毛色二孢全基因組12 902個蛋白序列進行預測篩選，最終獲得552個具有信號肽、不含有跨膜結構域和GPI錨定位點并可外泌到細胞外的具有典型特征的經典分泌蛋白，占全基因組預測蛋白總數的4.3%。

2.2 可可毛色二孢中分泌蛋白的信號肽特征

在552個具有分泌蛋白信號肽的蛋白序列中，蛋白序列長度最小的是66 aa，最大的長度是2 269 aa，大多集中于101—400 aa，占蛋白序列總數的54.5%（圖3），上述結果表明，可可毛色二孢中所預測的典型分泌蛋白多屬于小型蛋白。

信號肽氨基酸長度統計結果如圖4所示，候選分泌蛋白的信號肽長度多集中在18—20 aa，有253個，占預測分泌蛋白總數的45.8%；其中，含信號肽長度為20 aa的蛋白數量最多，有91個，占比16.5%。關于候選分泌蛋白的信號肽酶識別位點，利用LipoP v1.0[28]在線程序進行預測分析，結果表明含有Sp I型信號肽識別位點的分泌蛋白序列有522個，占比94.6%；另有10個分泌蛋白含有Sp II型信號肽識別位點，2個含有CYT型信號肽識別位點。以上結果說明大部分的可可毛色二孢候選分泌蛋白是通過Sp I型信號肽酶識別并切割掉信號肽。

進一步對20種氨基酸在候選分泌蛋白信號肽區段中的使用頻率進行統計分析，結果如圖5所示，在組成信號肽的20種氨基酸中，有129個丙氨酸（A），數量最多，占分泌蛋白總數的23.4%；其次為亮氨酸（L），數量為106個，占全部的19.2%；非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高（A、G、I、L、P和V），占蛋白總數的60.2%；其次是極性、不帶電荷的氨基酸（C、M、N、Q、S和T），占全部的27.2%；帶正電荷的堿性氨基酸（K、R和H）所占比例為5.2%；帶負電荷的酸性氨基酸（A和E）占23.7%；芳香族氨基酸（W、F和Y）占6.8%。

圖3 可可毛色二孢典型分泌蛋白的序列長度

圖4 可可毛色二孢分泌蛋白的信號肽長度分布

圖5 可可毛色二孢分泌蛋白氨基酸使用頻率

對可可毛色二孢候選分泌蛋白信號肽切割位點進行統計分析，結果如表3所示，在信號肽和成熟分泌蛋白切割位點-3、-2、-1、1、2、3位最多的氨基酸分別為A、L、A、A、P、T，所占比例分別為47.0%、16.4%、73.0%、27.3%、27.9%、14.0%。位于信號肽切割位點之前的-3、-2、-1位的氨基酸組成為A-S-A，屬于比較典型的A-X-A類型，可被Sp I型信號肽酶識別并切割，這與LipoP v1.0預測的結果相一致。

表3 可可毛色二孢分泌蛋白信號肽切割位點的氨基酸組成分布

2.3 可可毛色二孢全基因組候選分泌蛋白的功能預測

將預測的可可毛色二孢候選分泌蛋白在NCBI數據庫進行比對分析發現，216個分泌蛋白描述為功能未知的推定蛋白，其余336個則有明確的功能描述。在已有功能描述的這些分泌蛋白中，注釋功能主要集中在細胞壁組分降解相關的酶類，如蛋白酶、糖基水解酶、纖維素酶、角質酶、果膠裂解酶等，占比41.7%；此外還有CFEM結構域蛋白、FAD結合結構域蛋白、LysM結構域蛋白等結構域蛋白，以及與致病侵染相關的壞死誘導相關蛋白以及幾丁質結合蛋白等（表4）。并且上述候選分泌蛋白在序列長度、等電點、分子量和脂肪族氨基酸指數等方面均存在差異，推測其可能參與不同的生理活動。

2.4 分泌蛋白預測信號肽的生物學功能分析

借助pSUC2系統[30-31]驗證候選分泌蛋白的信號肽是否具有分泌功能。SUC2編碼一個果糖苷酶，可將蔗糖、棉籽糖等多糖酶解生成葡萄糖、果糖等單糖。將9個候選可可毛色二孢分泌蛋白信號肽融合至SUC2蛋白的氨基端，轉至酵母突變體YTK12中，若pSUC2融合載體成功轉化到酵母中，則能在CMD-W培養基中正常生長。隨后挑去生長的單斑，在棉籽糖培養基（YPRAA）上劃線，若預測的分泌蛋白信號肽能夠引導SUC2向胞外分泌，則可分泌到酵母細胞外將YPRAA培養基中的棉籽糖分解成單糖，酵母突變體就能正常生長，反之，則不會生長。結果如圖6所示，陰性對照Mg87酵母菌不能在YPRAA培養基上存活，陽性對照Avr1b的酵母菌可以在YPRAA培養基生長，而預測的9個分泌蛋白融合載體轉化的酵母可在YPRAA培養基上生長，表明上述分泌蛋白信號肽具有分泌活性，是典型的分泌蛋白。

表4 可可毛色二孢部分分泌蛋白生化特性與功能注釋

2.5 可可毛色二孢候選分泌蛋白基因的表達分析

在可可毛色二孢侵染初期，和的表達是持續下降的趨勢；在接種6 h后的表達量是接種0 h的2.5倍，隨后表達下調；、、、和的表達持續上調；而在接種12 h才表現出誘導表達（圖7）。結果表明，上述分泌蛋白可能在可可毛色二孢的侵染初期發揮一定的作用。

3 討論

在與宿主植物的協同進化過程中，病原真菌衍化出多種攻擊宿主的策略[11,32]。病原菌會通過分泌大量蛋白質來干擾宿主細胞功能并誘導其免疫反應，從而促進病原菌的侵染[14,33]。因此，利用全基因組測序信息，研究不同病原菌中分泌蛋白的數量、類型和特征以探究其致病機理尤為重要[34-36]。葡萄座腔病菌全基因組測序的完成和公布為該菌激發子、致病蛋白和效應子以及與宿主葡萄的互作研究提供了重要的數據支撐[22]。基于病原真菌分泌蛋白的典型結構特征，周曉罡等利用生物信息學分析軟件已對病原真菌以及卵菌等的分泌蛋白進行了預測[17-21]。本文基于以上研究，運用5種生物學軟件進行預測分析，保證了測試結果的準確性。LIU等研究表明，在侵染過程中，大豆疫霉（）分泌蛋白PsIsc1和大麗輪枝菌（）分泌蛋白VdIsc1可作為水解酶分解宿主植物的異分支酸合酶，破壞宿主的水楊酸代謝途徑，終止水楊酸介導的免疫反應從而使宿主更為感病[35]。值得關注的是，上述2種分泌蛋白均缺乏分泌信號肽。因此，對真菌分泌蛋白的篩選鑒定，不僅需要通過生物信息學的手段并結合生物學試驗進行驗證，還需要結合雙向電泳（2-DE）和質譜為基礎的蛋白質組學等技術進行多維度的挖掘[36]。

圖6 分泌蛋白信號肽功能驗證

圖7 9個候選分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染過程中的相對表達量

基于可可毛色二孢全基因組的12 902個蛋白序列，本研究預測得到552個經典分泌蛋白，占比4.3%。大多數候選分泌蛋白屬于小型蛋白（圖3），其信號肽長度多集中在18—20 aa（圖4），能夠被Sp I型信號肽識別并切割，這與前人所報道的有關植物病原真菌、卵菌等分泌蛋白無明顯差異[16-21]。分泌蛋白信號肽切割位點-3—+3位使用頻率最多是A、L、A、A、P、T（表3），切割位點上氨基酸使用種類較大麗輪枝菌[16]要多。切割位點-3和-1位的氨基酸使用種類最少，分別是16和18種（表3），這也與其他病原菌不同[17-21]。氨基酸使用頻率變化最大的在-1位，范圍從0（H，組氨酸；I，異亮氨酸）到73%（A，丙氨酸），與大麗輪枝菌、馬鈴薯晚疫病菌（）情況類似[16-21]，說明這一切割位點位置的保守性。

對于可可毛色二孢候選分泌蛋白功能注釋分析發現，39%預測為功能未知的假定蛋白，說明該菌候選蛋白的特異性，其功能有待于進一步驗證分析。植物病原真菌可能最初分泌細胞壁降解酶類來消化細胞壁的阻礙，以促進其侵入[37]。在有功能描述的候選分泌蛋白中（表4），其功能主要集中于降解細胞壁組分的酶類，如纖維素酶、果膠裂解酶和果膠酶等，這與其他病原真菌分泌蛋白的功能相似[17-21]。此外，預測有LysM結構域蛋白、幾丁質結合蛋白、壞死誘導蛋白等蛋白（表4），這些蛋白可能參與了可可毛色二孢的致病過程[38-39]。隨后，借助于pSUC2系統[30-31]對所選分泌蛋白信號肽進行了功能驗證，隨機挑選的9個候選蛋白信號肽均正常發揮作用，說明本研究預測方法的精準度較高（圖6）。進一步通過qPCR表達分析（圖7），驗證了候選分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染初期不同的表達模式，推測其在病原菌致病過程中發揮著不同的作用。

4 結論

基于病原真菌分泌蛋白具有的典型特征，利用在線生物信息學程序從可可毛色二孢全基因組中共預測獲得552個經典分泌蛋白，多屬于小型蛋白。其信號肽氨基酸長度分布廣泛，氨基酸組成中非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高。功能注釋主要集中在細胞壁組分降解相關的酶類、與致病侵染相關的壞死誘導相關蛋白以及幾丁質結合蛋白等。

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Prediction and analysis of Candidate Secreted Proteins from the Genome of

XING QiKai1, LI LingXian1, Cao Yang2, ZHANG Wei1, PENG JunBo1, YAN JiYe1, LI XingHong1

(1Institute of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Environment Friendly Management on Fruit Diseases and Pests in North China, Beijing 100097;2School of Biological Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning)

【】is an important phytopathogenic fungus with a worldwide distribution. This species causes severe Botryosphaeria dieback on a wide range of woody plants, which leads to reduced crop quality and tremendous economic losses. The objective of this study is to predict and analyze the candidate secreted proteins in the genome of, clarify their basic characteristics, so as to lay a foundation for the study of the pathogenic mechanism of secreted proteins in this pathogen.【】The signal peptide prediction algorithm SignalP v5.0 and subcellular localization prediction algorithm ProtComp v9.0, transmembrane helix prediction algorithm TMHMM v2.0, GPI-anchoring site prediction algorithm big-PI Fungal Predictor, and subcellular protein location distribution algorithm TargetP v2.0 were used to analyze 12 902 protein sequences ofpublished in the previous study. The basic features including the length of the N-terminal signal peptide, the frequency of amino acid usage and cleavage site of the predicted secreted proteins were statistically analyzed. Based on the homology of the protein sequence, biological function annotation of the predicted secreted proteins was clarified by using BLASTP program. The activity of the signal peptide of the selected secreted proteins was detected by yeast secretion and cell translocation assays. Expression patterns of the selected secreted protein genes duringinfection were analyzed by qRT-PCR technology.【】In this study, 522 secreted proteins were verified, accounting for 4.3% of the total proteins present in the genome of. The lengths of amino acids of secreted proteins were ranged from 101 to 400 aa. The distribution length of signal peptides was from 18 to 20 aa and the largest number was 20 aa. The top frequent amino acid was alanine in the signal peptides, and the most frequently incorporated amino acids were non-polar and hydrophobic, accounting for 60.2% of the total amino acids. Further, the amino acids in the position -3 to -1 in the signal peptides were relatively conserved and the signal peptide cleavage site belonged to A-X-A type, which could be recognized and cleaved by Sp I type peptidase. Among them, 336 secreted proteins were identified with a predictive function, which was mostly enzymatic or virulence-associated protein. Besides, there are differences in terms of molecular weight, isoelectric point, the aliphatic index in the candidate secreted proteins.Finally, the predicted signal peptides of the 9 putativesecreted proteins were confirmed to have secretory activity by using a yeast invertase secretion assay. qRT-PCR analysis demonstrated that the expression of selected protein genes was differentially regulated during host infection.【】A total of 552 candidate secreted proteins ofwere predicted by a set of computer algorithms. Lengths of the signal peptides vary greatly and the most frequently are mainly non-polar and hydrophobic amino acids. Secreted proteins characterized in this study can be categorized under enzymes related to the degradation of cell wall components, necrosis induction proteins, and chitin-binding proteins which may play an important role inpathogenetic mechanism.

Botryosphaeria dieback;; bioinformatics; secreted protein; signal peptide; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.006

2020-02-14；

2020-03-20

國家自然科學基金（31801686）、北京市自然科學基金（6184041）、北京市農林科學院科技創新能力建設（KJCX20190406）

邢啟凱，E-mail：qikaixing@163.com。通信作者李興紅，Tel：010-51503510；E-mail：lixinghong1962@163.com

（責任編輯 岳梅）