丹參酮Ⅱ A 對結腸癌細胞株Caco-2 的作用

唐江鋒 單麗紅 柳開忠

（中國科學院大學附屬腫瘤醫院< 浙江省腫瘤醫院>< 中國科學院腫瘤與基礎醫學研究所> 浙江 杭州 310022）

結腸癌是嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤之一，早期不易發現，而多數中晚期患者仍死于復發或轉移。部分患者對化療藥物不敏感，且化療藥物不良反應多。因此，充分發揮中醫中藥作用，積極尋找天然抗腫瘤中藥成分成為時下熱點。近年來對中藥丹參的研究逐漸增多， 丹參有效成分中的丹參酮Ⅱ A（Tanshinone Ⅱ A， Tan Ⅱ A）具有較強的抗腫瘤活性[1]，但有關丹參酮Ⅱ A 與結腸癌之間的機制研究尚不多。本文擬采用不同濃度的丹參酮Ⅱ A 體外干預結腸癌細胞株Caco-2，觀察其對Caco-2 細胞的作用，并對其相關機制進行初步研究。

1.材料與方法

1.1 主要材料

人結腸癌細胞株Caco-2 購自中國科學院上海細胞庫，Tan Ⅱ A 購自中國藥物制品檢定所，胎牛血清、DMEM 高糖培養基購自Gibco，MTT 購于碧云天生物技術研究，Trizol 試劑盒、RT-PCR 試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養

將人結腸癌Caco2 細胞株培養于DMEM 高糖培養基中，加入10%胎牛血清，置于5% CO2濃度，37℃培養箱中培養。

1.2.2 引物設計

β-actin（F：5’-TGGCACCCAGCACAATGAA-3’；R：5’-CTA AGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’）

Smad4（F：5’-GAGAACTITGCCGTTGAAGC-3’；R：5’-CTCAATGTCAAGGGCCATCT-3'）

Smad2（F：5’-T T T G C G G A A T A A T C G T G T-3’；R：5’-AAGGTGCTTTAATTGATGAGAC-3’）

1.2.3 MTT 法檢測細胞增殖抑制率

收集對數生長期的Caco2 細胞，用0.25%胰酶消化、收集細胞、計數細胞密度，制備成2×104/ml 細胞懸液，接種于96孔板內，每孔加入200mL 細胞懸液，培養24h 后，將其分為 4個實驗組，分別加入不同濃度TanⅡ A培養液，使其終濃度為0.3、0.6、1.2、2.4mg/L，另設不加細胞只加等量培養液的對照組。分別作用24h、48h、72h 后，每孔加入新鮮配置的5g/L MTT 溶液20μL，繼續37℃孵育4h 后棄上清，再加入150μL DMSO，震蕩10min 后，使用酶標測定儀測定吸光度(OD)值，并計算細胞抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%。

1.2.4 RT-PCR

分別收集對照組、Tan Ⅱ A 1.2mg/L 組，Tan Ⅱ A 2.4mg/L組處理72 小時后的Caco-2 細胞，按Trizol 試劑盒說明方法提取細胞總RNA，再根據One Step RT-PCR 試劑盒說明書，按照25 μl 體系，以β-actin 為內參照進行操作。最后觀測擴增曲線及溶解曲線，根據2-ΔΔct分析結果。

1.3 統計學方法

本組數據應用SPSS 20.0 統計軟件處理， 計量資料數據均以均數±標準差(x±s)表示，各組間比較采用方差分析， P＜0.05 具有統計學意義。

2.結果

2.1 MTT 法測定Tan Ⅱ A 對Caco-2 增殖抑制率的影響

不同濃度的Tan Ⅱ A 對Caco-2 細胞增殖抑制率的影響，見表1。不同藥物濃度組與對照組之間的細胞增殖抑制率均有統計學差異（P ＜0.05），同一藥物濃度組以72 小時抑制率最高。而同樣作用72 小時，以2.4mg/L 組抑制率最高，見表1。

表1 Tan II A 對Caco-2 增殖抑制率的影響

2.2 Tan Ⅱ A 對Caco-2 Smad4 和Smad2 mRNA 表達的影響

利用RT-PCR技術檢測Smad4和Smad2 mRNA表達情況，見圖1。與對照組相比，Tan Ⅱ A 1.2mg/L 和2.4mg/L 實驗組Smad4、Smad2 mRNA 表達明顯增多（P ＜0.01）。

圖1 TanII A 干預Caco-2 細胞72 小時后Smad4 mRNA、Smad2 mRNA 的RT-PCR結果

3.討論

結腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，其發生發展是一個多步驟、多階段的過程，早期癥狀不明顯，許多病人發現時已屬中晚期，即使是結腸癌早期患者接受了根治性手術及輔助治療，也仍有約半數術后患者死于復發和轉移[2]。

Smad 蛋白家族是轉化生長因子β（transforming growth factor beta，TGF-β）家族的重要下游信號分子，在信號轉導、調節靶基因的轉錄過程中發揮著重要的作用。Smad 蛋白根據結構和功能的不同分為受體激活型Smads、共同介導型Smads 及抑制型Smads。Smad2 屬于受體激活型Smad 蛋白，可被TGF-β的I 型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體磷酸化，隨后與共同介導型的Smad4 蛋白形成異源性多聚體，并進入核內與DNA 特異性短序列SBE-Smads 結合，激活DNA 轉錄，調節靶蛋白的表達[3]。其中Smad4 基因位于人染色體18q21，是首先在胰腺癌中發現的抑癌基因，其所編碼的Smad4 蛋白是TGF-β/Smad 信號通路的中心分子，在信號轉導、調節靶基因的轉錄過程中發揮重要的作用，所有生物學效應都是不同類型Smads 蛋白與Smad4 相互作用的結果[4]。有研究[5]發現約1/3的結腸癌患者存在Smad4缺失或突變，而結腸癌患者中也常有Smad2 基因的失活，而這種突變、缺失和失活與結腸癌的惡化及侵襲轉移密切相關，且Smad2、Smad4 蛋白低表達的結腸癌患者往往不良預后[6]。

丹參酮Ⅱ A 是從中藥丹參中提取的脂溶性有效成分，其不僅具有抗炎，抗氧化和抗纖維化的作用，還具有抗腫瘤的作用。近年來的研究發現，丹參酮ⅡA 具有誘導腫瘤細胞分化和凋亡的作用，并可通過細胞毒作用抑制腫瘤細胞的增殖[7]。本研究發現丹參酮Ⅱ A 能抑制結腸癌Caco-2 細胞增殖，同一藥物濃度組作用24、48、72 小時后，以72 小時抑制率最高。進一步的PCR分析發現丹參酮Ⅱ A 實驗組Smad2、Smad4 mRNA 表達較對照組顯著升高。這些結果提示丹參酮Ⅱ A 能抑制結腸癌細胞Caco-2增殖生長，其機制可能是通過調節Smad2、Smad4 表達進而達到抑制腫瘤的目的。

綜上所述，丹參酮Ⅱ A 能夠抑制結腸癌細胞株Caco-2 的增殖，其機制可能與丹參酮Ⅱ A 上調Smad2、Smad4 表達有關，為中醫中藥治療結腸癌提供新思路。